本發(fā)明涉及生鮮果蔬微生物安全領域，具體涉及有機酸中檸檬酸和次氯酸鈉復配對食源性致病菌的協(xié)同殺菌作用及在實際食品體系的應用效果，技術研究并對協(xié)同殺菌機制進行解析，旨在開發(fā)一項可應用于生鮮果蔬表面清洗消毒的方法。

背景技術：

1、食源性疾病是全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，每年約有6億人患食源性疾病，導致約42萬人死亡。其中生鮮果蔬的微生物污染是食源性疾病產(chǎn)生的重要原因，因此對生鮮果蔬表面清洗消毒成為技術研究關鍵。生鮮果蔬產(chǎn)品中綠葉蔬菜(如生菜、菠菜等)與藤蔓類蔬菜(如番茄)為主要易受微生物污染的生鮮果蔬，因其導致食源性疾病分別占與果蔬相關的食源性疾病的22～30％與6～8％。生鮮果蔬中易感染的食源性致病菌主要有鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌o157:h7、李斯特菌、假單胞菌等。沙門氏菌屬于革蘭氏陰性的桿狀腸道致病菌，在所有食源性致病菌中，沙門氏菌每年引發(fā)的食物中毒事件數(shù)量位居首位，世界各國每年有上百萬人感染沙門氏菌，且在美國有沙門氏菌引起的果蔬感染率占到33.7％，其危害十分嚴重。因此在食品安全方面的防范對于預防沙門氏菌感染至關重要。同時大腸桿菌o157:h7作為革蘭氏陰性菌的也產(chǎn)生較為廣泛的食源危害性，具有暴發(fā)流行趨勢及強致病性。它具有耐低溫特性且在自然界的水中可存活數(shù)月，這些因素使其在感染過程中對于時間、空間的限制性降低。

2、應用于農(nóng)產(chǎn)品殺菌的各類新興的非熱消毒技術受到廣泛研究，但由于設備或成本較高，難以得到大規(guī)模應用。化學消毒劑具有成本低、消毒性好、能夠以不同比例與水混合等優(yōu)點，而被廣泛應用。目前氯基消毒液是最常用的果蔬清洗劑，但在果蔬洗滌水中使用次氯酸鈉會產(chǎn)生低濃度的致癌化合物，如三鹵甲烷和亞氯酸鹽殘留物等，對人體造成一定危害。為了防止病原體或清洗水源交叉污染，對消毒液的游離氯濃度要求較高。過氧乙酸被作為氯基消毒劑的替代品而受到關注，但因其具有強氧化性與腐蝕性，清洗可能對果蔬中維生素c等營養(yǎng)物質(zhì)造成化學損傷，影響果蔬品質(zhì)和營養(yǎng)價值。利用有機酸復配該類常用消毒劑可以增強次氯酸鈉單獨使用時的抑菌消毒作用，同時合理減少氯基消毒液的用量，達到更加理想清除生鮮果蔬表面細菌的目的。

3、檸檬酸等有機酸為目前果蔬清洗劑中良好的替代品，其在未解離前具有親脂性，穿過細胞膜進入細胞后有機酸會發(fā)生解離，而帶電的陰離子和質(zhì)子不能穿過質(zhì)膜，導致細胞內(nèi)的ph值降低，從而誘導細胞損傷以及酶、結構蛋白和dna功能的改變。其中檸檬酸具有較好廣譜抑菌能力，對多種食源性致病菌如大腸桿菌o157:h7、金黃色葡萄球菌等均有抑制作用，且在與不同類型物質(zhì)復配中均表現(xiàn)出較好協(xié)同作用。酒石酸是一種天然存在的有機酸，廣泛存在于葡萄、柑橘等水果中，它的低毒性使得其在食品工業(yè)中有較好的安全性，同時其良好的抗氧化功能使其在果蔬保鮮中的應用更為突出。但單獨使用有機酸成本較高且有機酸本身的酸性氣味會對果蔬感官造成影響。綜上，本研究擬探索將有機酸與常用消毒劑復配使用是否能發(fā)揮并協(xié)同提高各自殺菌優(yōu)勢，通過復配達到更高效果蔬清洗殺菌效果。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高效的生鮮果蔬表面清洗消毒劑制備方法，可用作生鮮果蔬表面清洗消毒的新型復配消毒劑，該新型復配消毒劑對鮮果蔬產(chǎn)品易感染的食源性致病菌鼠傷寒沙門氏菌(salmonella?typhimurium)及大腸桿菌o157:h7(e.coli?o157:h7)均有高效抑制效果，其具體復配配方為：低濃度次氯酸鈉與檸檬酸的混合溶液。

2、所述的生鮮果蔬表面清洗消毒劑中檸檬酸的濃度為3.5～4.5mm；

3、所述的生鮮果蔬表面清洗消毒劑中有效氯含量為70.0～80.0ppm。

4、進一步優(yōu)選，所述的生鮮果蔬表面清洗消毒劑中檸檬酸的濃度為3.8～4.2mm；所述的生鮮果蔬表面清洗消毒劑中有效氯含量為73～77ppm。最優(yōu)選，所述的生鮮果蔬表面清洗消毒劑中檸檬酸的濃度為4.0mm；所述的生鮮果蔬表面清洗消毒劑中有效氯含量為75.0ppm。

5、一種可應用于生鮮果蔬表面清洗消毒新型便捷的方法，可應用在生鮮果蔬前處理過程，以發(fā)揮高效抑制食源性致病微生物、長效保鮮的作用，其篩選優(yōu)化得到配方為：

6、該復配消毒劑為低濃度次氯酸鈉與檸檬酸的混合溶液(其中含有摩爾濃度為4.0mm檸檬酸溶液與有效氯含量為75.0ppm的次氯酸鈉的混合溶液)。

7、本發(fā)明以檸檬酸和酒石酸兩種典型有機酸與次氯酸鈉溶液這種常見食品消毒劑為原料，優(yōu)化復配比例，篩選得到抗菌協(xié)同效果最佳的復配組合。研究將該方法應用于實際果蔬清洗中，有效降低櫻桃番茄與生菜表面食源性致病菌的殘余量。同時機制研究為復配殺菌的實際應用提供理論基礎，以更高效發(fā)揮有機酸與常用消毒劑的殺菌優(yōu)勢。本發(fā)明的技術方案為實現(xiàn)新型且更安全綠色的果蔬表面微生物防控方法提供支持，具有重要的研究意義和重大的經(jīng)濟價值與市場需求。

8、生鮮果蔬表面清洗消毒劑的制備方法，包括以下步驟：

9、(1)將固體化學藥品檸檬酸均勻溶解在水中，制備檸檬酸溶液，作為母液1；

10、(2)利用水稀釋次氯酸鈉，作為母液2；

11、(3)將母液1與母液2混合，得到生鮮果蔬表面清洗消毒劑，用于生鮮果蔬表面清洗消毒。

12、進一步優(yōu)選，應用于生鮮果蔬表面清洗消毒的新型方法，包括以下步驟：

13、(1)將固體化學藥品檸檬酸均勻溶解在純凈水中，制備得濃度為8.0mm的檸檬酸溶液，作為母液1。

14、(2)利用純凈水稀釋化學藥劑次氯酸鈉溶液，使其有效氯含量在150.0ppm，作為母液2。

15、(3)將母液1與母液2以等體積比1:1混合，得到可應用于生鮮果蔬表面清洗消毒的新型復配消毒劑。

16、步驟(1)中，摩爾濃度為8.0mm檸檬酸溶液即制備含有質(zhì)量分數(shù)1.537g/l檸檬酸溶液。

17、步驟(2)中，即配制有效氯含量為150.0mg/l的次氯酸鈉溶液。

18、步驟(2)中，次氯酸鈉質(zhì)量濃度(mg/l)＝有效氯含量(mg/l)/次氯酸鈉溶液中的氯含量(％)，其中化學藥劑次氯酸鈉溶液的具體氯含量可以用碘量法或amplite熒光法次氯酸檢測試劑盒的方式準確測定。

19、步驟(3)中，等體積比1:1混合以保證復配消毒劑中最終含有4.0mm檸檬酸溶液與有效氯含量75.0ppm的次氯酸鈉的混合溶液，該復配應消毒劑現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證最佳效果。

20、具體地，篩選優(yōu)化得到用作生鮮果蔬表面清洗消毒的新型復配消毒劑的制備方法與應用效果及作用機制研究，主要包括以下步驟：

21、(1)最小抑菌濃度和殺菌濃度的測定：首先配置各濃度梯度檸檬酸溶液、酒石酸溶液及次氯酸鈉溶液。采用二倍稀釋法測定化學消毒劑對兩種有害致病菌s.typhimurium及e.coli?o157:h7的最小抑菌濃度(mic)，從取上述mic濃度溶液處理后在pca培養(yǎng)基上培養(yǎng)測定最低殺菌濃度(mbc)。

22、(2)不同復配方式協(xié)同效果的測定與篩選：以步驟(1)中三種化學消毒劑的mic值為參照，設置不同濃度梯度的檸檬酸溶液、酒石酸溶液與不同濃度梯度次氯酸鈉溶液進行復配。利用fici法確定兩種試劑在聯(lián)合使用時是否具有協(xié)同效應、加法效應等。對多種復配組合進行抗菌效果比較，篩選優(yōu)化得到四種抗菌協(xié)同效果較好的復配組合。

23、(4)四種復配組合對兩種食源性致病菌的時間-殺傷曲線測定：為驗證篩選到的復配方式的殺菌效果，采用菌落計數(shù)法進行時間依賴性殺菌實驗。配置菌懸液接種于不同樣品培養(yǎng)液，進行孵育，并按時平板涂布并計數(shù)菌落。繪制平均菌落(log?cfu/ml)與時間的關系曲線。

24、(5)在生鮮果蔬清洗中復配組合殺菌的效果評定：以櫻桃番茄與生菜兩類易被食源性致病菌污染的的生鮮果蔬為實驗對象，將兩種主要食源性致病菌等比例混勻。接種于果實使病原體附著。分別制備對照組、清水組及樣品組，在清洗后自然晾干，最終計數(shù)各組剩余的致病菌數(shù)量(cfu/cm2)。

25、(6)復配溶液處理后細菌形態(tài)觀察：利用掃描電鏡觀察處理后的細菌細胞形態(tài)變化，選取檸檬酸與次氯酸鈉最佳復配組合溶液處理s.typhimurium(atcc?14028)細胞，并進行電鏡觀察前處理，將樣品貯藏在100％乙醇中，干燥后鍍金處理，再用掃描電鏡進行觀察。

26、(7)細菌細胞膜功能性變化分析：通過測定胞內(nèi)核酸及蛋白質(zhì)泄露量，利用pi熒光染色法分析復配清洗消毒劑作用后細胞膜完整性的變化；同時評定對細菌細胞膜電位的影響；利用clsm激光共聚焦觀察熒光染色后細胞質(zhì)膜的損傷情況，從細胞膜形態(tài)與性質(zhì)變化角度探究經(jīng)優(yōu)化出的復配清洗消毒劑的殺菌作用機理。

27、優(yōu)選的，在抗菌效果探究中兩種生鮮果蔬中主要有害致病菌選擇為s.typhimurium(atcc?14028)及e.coli?o157:h7(atcc?35150)。

28、優(yōu)選的，步驟(1)中，后期為得到準確mic，在二倍稀釋法測出mic所在范圍后進而配置特定小范圍內(nèi)濃度梯度進行測定。mbc鑒定標準為pca培養(yǎng)基上生長菌落低于5個的復配濃度即為mbc值。

29、優(yōu)選的，步驟(2)中，利用fici法測定多藥物在聯(lián)合使用時協(xié)同效果時，利用棋盤法及單一變量法，所需檸檬酸、酒石酸與次氯酸鈉溶液的不同復配比例為fic有機酸取1/3；1/2；2/3，fic消毒劑取1/4～2/3之間。

30、優(yōu)選的，步驟(4)中菌懸液濃度為106cfu/ml，對照組為質(zhì)量分數(shù)0.85％生理鹽水，培養(yǎng)溫度為37℃，孵育時間為0、2、4、6、12、24h。

31、優(yōu)選的，步驟(5)中櫻桃番茄需用酒精擦拭以消除表面蠟質(zhì)，櫻桃番茄及生菜均依次用純凈水沖洗并放入超凈臺紫外殺菌2h，以消除果皮上天然菌群的存在。

32、優(yōu)選的，步驟(5)中對照組、清水組及樣品組在清洗后自然晾干，放入含有10ml質(zhì)量分數(shù)0.85％生理鹽水的均質(zhì)袋中進行2min均質(zhì)處理，接著利用平板稀釋涂布計數(shù)法計算最終致病菌數(shù)量。

33、優(yōu)選的，步驟(6)中前處理應嚴格按照要求進行，戊二醛溶液固定，磷酸緩沖液(pbs)洗滌，1％的鋨酸固定，pbs繼續(xù)洗滌，梯度濃度乙醇溶液脫水。觀察時用掃描電鏡觀察倍數(shù)為40,000×和20,000×，標記單位分別為2μm，1μm。

34、優(yōu)選的，步驟(7)中對優(yōu)化得到復配消毒劑的對細菌細胞膜功能性改變的各項指標測定均應嚴格按照說明書中具體實施方式進行測定。

35、本發(fā)明具有以下技術效果：

36、在全球食源性疾病高發(fā)背景下，生鮮果蔬的表面清洗消毒成為技術研究關鍵。常用氯基消毒液長期在生鮮果蔬上的應用對人體存在潛在危害，可用于食品體系消毒的有機酸如檸檬酸、酒石酸符合gras標準。研究選擇檸檬酸與酒石酸兩種有機酸復配次氯酸鈉溶液這種常用消毒劑，嘗試在實際生產(chǎn)中減少次氯酸鈉用量，使生鮮果蔬表面清洗更加綠色安全，同時降低成本。

37、檸檬酸、酒石酸與次氯酸鈉溶液按比例復配，篩選優(yōu)化出抗菌協(xié)同效果最佳復配組合，在對櫻桃番茄及生菜兩類生鮮果蔬清洗中評價了對果蔬中常見的兩種典型食源性致病菌s.typhimurium及e.coli?o157:h7的高效抗菌效果，進一步從細胞膜形態(tài)及性質(zhì)變化角度分析了復配清洗消毒劑抗菌的分子機制。

38、該技術的方法旨在應用于生鮮果蔬清洗抑菌，本次研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸與次氯酸鈉消毒劑復配具有良好協(xié)同抗菌效果，同時優(yōu)化兩者比例得到的復配清洗消毒劑對櫻桃番茄及生菜表面食源性致病菌有顯著殺菌作用，該技術方法更加安全綠色的解決了果蔬的病原菌污染問題，高效保障果蔬品質(zhì)及食用安全性，同時協(xié)同抑菌機制的探究也為技術提供理論基礎。