本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物在制藥中的新用途，尤其是穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了補(bǔ)體系統(tǒng)是由35種廣泛存在于血清、組織液和細(xì)胞膜表面具有酶活性的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)，它是人體重要的免疫系統(tǒng)之一，在機(jī)體抗感染第一線防御中起重要作用，正常激活對(duì)消滅外來微生物、抑制過度炎癥反應(yīng)以及維持機(jī)體的平衡中起著重要的作用。但補(bǔ)體系統(tǒng)非正常激活會(huì)引發(fā)許多嚴(yán)重的疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合癥、流感、非典等均與補(bǔ)體系統(tǒng)異常激活有關(guān)。因此臨床急需安全有效的補(bǔ)體抑制劑，我國傳統(tǒng)的若干清熱解毒藥物對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活引發(fā)的疾病療效明確，從中尋找高效、低毒的補(bǔ)體抑制劑具有很強(qiáng)的針對(duì)性和現(xiàn)實(shí)意義。

穿心蓮Andrographis paniculata是我國使用廣泛、療效顯著的傳統(tǒng)清熱解毒中藥，對(duì)扁桃體炎、流感、普通感冒均有可靠療效，體外溶血實(shí)驗(yàn)表明穿心蓮醇提物的確具有明顯的抗補(bǔ)體活性，對(duì)經(jīng)典途徑激活的IC₅₀為0.029mg/ml，但是穿心蓮主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯并未見其抗補(bǔ)體活性的報(bào)道，尤其是有關(guān)對(duì)映半日花烷型二萜類化合物的抗補(bǔ)體活性迄今未見有報(bào)道。

基于此，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物在制藥中的新用途，尤其是穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物在制藥中的新用途，尤其是穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。

本發(fā)明中采用活性導(dǎo)向分離方法確認(rèn)穿心蓮中的抗補(bǔ)體活性物質(zhì)為對(duì)映半日花烷型二萜類化合物，本發(fā)明中，涉及穿心蓮中具有抗補(bǔ)體活性的化合物為

其中的9個(gè)對(duì)映半日花烷型二萜類化合物：

14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographiside(1)、6′-Acetylneoandrographolide(2)、14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographolide(3)、14-去氧穿心蓮苷(14-deoxyandrograp-hiside,4)、14-deoxy-8,17-epoxy-andrographolide(5)、14-deoxy-11-oxo-andrographolide(6)、 Wightiolide(7)、19-O-β-D-glucopyranosyl-ent-labda-8(17)13-dien-15,16,19-triol(8)和Andrographatoside(9)。其中1為新化合物。

本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代化學(xué)與藥理研究方法，從穿心蓮醇提物中活性導(dǎo)向分離得到上述對(duì)映半日花烷型二萜類化合物，并對(duì)得到的單體化合物進(jìn)行抗補(bǔ)體活性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，上述二萜化合物對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑均有較強(qiáng)的抑制作用。

更具體的，本發(fā)明的對(duì)映半日花烷型二萜類化合物為具有以下結(jié)構(gòu)通式的化學(xué)結(jié)構(gòu)：

其中，

化合物1為14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographiside；

化合物2為6′-Acetylneoandrographolide；

化合物3為14-deoxy-11(R)-hydroxyandrographolide；

化合物4為14-deoxyandrographiside(14-去氧穿心蓮苷)；

化合物5為14-deoxy-8,17-epoxy-andrographolide；

化合物6為14-deoxy-11-oxo-andrographolide；

化合物7為Wightiolide；

化合物8為19-O-β-D-glucopyranosyl-ent-labda-8(17),13-dien-15,16,19-triol；

化合物9為Andrographatoside。

本發(fā)明所述的對(duì)映半日花烷型二萜類化合物通過下述方法制備：

穿心蓮藥材(市購)，粉碎，用95％乙醇回流提取3次，合并提取液并濃縮得浸膏，其中取浸膏用水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到萃取后浸膏，通過體外溶血試驗(yàn)，確定活性部位為乙酸乙酯部位，經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(70:1-0:1)梯度洗脫，得到9個(gè)流份Fr.1-9；流份Fr.1用大孔樹脂D101分離，用乙醇:水(20％,40％,60％,80％,100％乙醇)依次洗脫，再經(jīng)過凝膠LH-20(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脫)及HPLC制備液相(42％甲醇/水)純化得到化合物2、3；流份Fr.3用硅膠柱以乙酸乙酯:甲醇(80:1-甲醇)梯度洗脫，再經(jīng)D101(40％,80％乙醇/水洗脫)分別得D1、D2流份，其中D1流份用硅膠柱以二氯甲烷/甲醇(10:1)洗脫及HPLC制備液相(48％甲醇/水)純化得到化合物4，D2流份經(jīng)HPLC制備液相(36％乙腈/水)純化得到化合物5、6、7；流份Fr.6經(jīng)ODSC₁₈柱以甲醇:水(1:4-9:1)進(jìn)行梯度洗脫，再經(jīng)LH-20凝膠柱(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脫)和HPLC制備液相(21％乙腈/水)進(jìn)行純化分離，得到化合物1、8、9。

鑒定結(jié)果顯示：

化合物(1)，白色無定型粉末，分子式：C₂₆H₄₀O₁₀，分子量：512；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:7.34(1H,br s,H-14),5.14(1H,s,H-17a),5.78(1H,s,H-17b),4.82(1H,m,H-11),4.60(1H,br s,H-15a),4.69(1H,br s,H-15b),4.73(1H,d,J＝11.0Hz H-19b),3.93(1H,d,J＝11.0Hz,H-19a),4.88(1H,d,J＝8.0Hz,H-1'),1.46(3H,s,H-18),1.49(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:16.8(C-20),24.3(C-18),25.5(C-6),29.0(C-2),34(C-12),37.5(C-1),39.8(C-7),40.3(C-10),43.3(C-4),56.4(C-5),60.3C-9),67.4(C-11),70.6(C-15),71.9(C-19),79.0(C-3),110.3(C-17),131.9(C-13),146.1(C-8),147.5(C-14),174.9(C-16),62.5(C-6′),71.4(C-4′),74.7(C-2′),78.5(C-3′),78.6(C-5′),105.4(C-1′)；

化合物(2)，白色無定型粉末，分子式：C₂₈H₄₂O₉，分子量：522；¹H-NMR(400MHz,CD₃OD),δ_H:7.34(1H,br s,H-14),4.82(2H,br s,H₂-15),4.89(1H,br s,H-17b),4.64(1H,brs,H-17a),4.05(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),3.23(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),4.17(1H,d,J＝8.0Hz,H-1'),δ_H3.14-4.03為葡萄糖質(zhì)子信號(hào),δ_H1.02(3H,s,H-19)，δ0.70(3H,s,H-20)為兩個(gè)角甲基信號(hào),乙?；卣餍盘?hào)δ_H2.03(3H,s),δ_C172.8.¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD),δ_C:16.1(C-20),20.1(C-2),23.1(C-11),25.6(C-6),25.7(C-12),28.4(C-18),37.1(C-3),39.4(C-10),39.8(C-7),40.3(C-1),40.8(C-4),57.8(C-5),58.0(C-9),72.1(C-15),72.9(C-19),107.5(C-17),135.0(C-13),147.8(C-14),148.3(C-8),177.1(C-16),65.2(C-6′),72.2(C-4′),75.3(C-2′),75.3(C-5′),78.2(C-3′),104.6(C-1′)；

化合物(3)，白色無定型粉末，分子式：C₂₀H₃₀O₅，分子量：350；¹H-NMR(400MHz, CD₃OD)δ_H:7.37(1H,brs,H-14),5.20(1H,s,H-17a),4.96(1H,s,H-17b),4.83(1H,br s,H-15a),4.83(1H,br s,H-15b),4.37(1H,m,H-11),4.15(1H,d,J＝12.0Hz H-19b),3.36(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),1.59(1H,s,H-9),δ1.19(3H,s,H-18)，δ1.04(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,CD₃OD),δ_C:16.1(C-20),21.9(C-18),24.1(C-6),27.5(C-2),32.5(C-12),36.3(C-10),38.8(C-1),39.8(C-7),42.3(C-4),55.9(C-5),59.7C-9),63.5(C-19),67.2(C-11),70.7(C-15),79.7(C-3),109.5(C-17),130.8(C-13),145.0(C-14),148.1(C-8),175.7(C-16)；

化合物(4)，白色結(jié)晶，分子式：C₂₆H₄₀O₉，分子量：496；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:7.22(1H,br s,H-14),4.91(1H,s,H-17a),4.73(1H,s,H-17b),4.77(2H,brs,H₂-15),4.64(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),3.86(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),δ1.46(3H,s,H-18),δ0.83(3H,s,H-20),葡萄糖端基質(zhì)子信號(hào)：δ_H4.82(1H,d,J＝8.0Hz,H-1'),¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.0(C-20),22.3(C-11),24.5(C-18),25.0(C-12),25.4(C-6),29.2(C-2),37.8(C-1),38.8(C-7),39.7(C-10),43.3(C-4),55.7C-5),56.6(C-9),70.7(C-15),72.1(C-19),79.1(C-3),107.0(C-17),134.1(C-13),145.6(C-14),148.2(C-8),174.8(C-16),62.7(C-6′),71.6(C-4′),74.8(C-2′),78.6(C-5′),78.7(C-3′),105.5(C-1′)；

化合物(5)，白色粉末，分子式：C₂₀H₃₀O₅，分子量：350；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅),δ_H:7.19(1H,br s,H-14),4.71(1H,s,H-15a),4.70(1H,br s,H-15b),4.46(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),3.66(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),2.74(1H,d,J＝4.1Hz,H-17a),2.48(1H,d,J＝4.1Hz,H-17b),兩個(gè)角甲基δ_H1.51(3H,s,H-18)，δ0.76(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.2(C-20),20.1(C-11),21.9(C-6),23.5(C-18),27.4(C-12),28.2(C-2),36.7(C-1),37.0(C-7),39.9(C-10),43.0(C-4),50.2C-17),53.4(C-9),54.7(C-5),58.6(C-8),64.0(C-19),70.5(C-15),79.6(C-3),133.8(C-13),145.3(C-14),174.5(C-16)；

化合物(6)，白色粉末，分子式：C₂₀H₂₈O₅，分子量：348；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:7.5(1H,br s,H-14),4.77(2H,br s,H₂-15),4.90(1H,br s,H-17a),4.76(1H,brs,H-17b),4.47(1H,d,J＝12.0Hz,H-19b),3.15(1H,d,J＝12.0Hz,H-19a),兩個(gè)角甲基δ_H1.49(3H,s,H-18),1.21(3H,s,H-20),¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.5(C-20),23.4(C-18),23.7(C-6),28.5(C-2),36.6(C-1),36.7(C-7),39.8(C-10),41.8(C-12),43.1(C-4),54.6(C-5),63.8(C-19),67.8(C-9),70.9(C-15),79.7(C-3),109.2(C-17),127.0(C-13),144.5(C-8),149.2(C-14),174.1(C-16),205.7(C-11)；

化合物(7)，白色粉末，分子式：C₂₀H₃₀O₄，分子量：334；¹H-NMR(400MHz, Pyridine-d₅),δ_H:7.15(1H,brs,H-14),4.72(2H,brs,H₂-15),4.92(1H,br s,H-17a),4.74(1H,br s,H-17b),4.15(2H,br t,J＝12.0Hz,H₂-19),3.99(1H,d,J＝12.0Hz,H-18a),3.92(1H,d,J＝12.0Hz,H-18b),1個(gè)角甲基δ_H 0.77(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:14.8(C-20),18.6(C-2),21.6(C-11),24.3(C-6),24.7(C-12),29.7(C-3),38.2(C-7),38.4(C-1),39.3(C-10),42.9(C-4),49.3(C-5),56.3(C-9),62.5(C-18),68.9(C-19),70.0(C-19),106.2(C-17),133.6(C-13),144.7(C-14),147.9(C-8),174.1(C-16)；

化合物(8)，白色粉末，分子式：C₂₆H₄₄O₈,分子量：484；¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅),δ_H:5.93(1H,t,J＝6.2Hz,H-14),4.87(1H,s,H-17a),4.63(1H,s,H-17b),4.73(1H,br s,H-15a),4.64(1H,br s,H-15b),4.55(1H,br s,H-16a),4.53(1H,br s,H-16b),4.82(1H,d,J＝8.0Hz,H-1′),δ_H3.5-4.3為葡萄糖質(zhì)子信號(hào)，δ1.18(3H,s,H-19),δ0.63(3H,s,H-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅),δ_C:15.4(C-20),19.2(C-2),22.6(C-11),24.5(C-6),28.0(C-18),34.3(C-12),36.2(C-3),38.5(C-7),38.7(C-4),38.8(C-1),39.6(C-20),56.1(C-5),56.7(C-9),58.3(C-16),59.7(C-15),72.4(C-19),106.7(C-17),127.2(C-14),142.6(C-13),148.8(C-8),62.6(C-6′),71.5(C-4′),75.1(C-2′),78.2(C-5′),78.5(C-3′),105.3(C-1′)；

化合物(9)，白色粉末，分子式：C₂₆H₄₂O₉，分子量：498，¹H-NMR(400MHz,Pyridine-d₅)δ_H:6.25(1H,d,J＝8.0Hz,H-1’),5.95(1H,t,J＝6.2Hz,H-14),4.85(1H,s,H-17a),4.25(1H,s,H-17b),4.65(2H,d,J＝6.6Hz,H₂-15),4.57(1H,d,J＝12.0Hz,H-16a),4.53(1H,d,J＝12.0Hz,H-16b),δ_H3.9-4.41為葡萄糖質(zhì)子信號(hào),1.28(3H,s,Me-18),0.92(3H,s,Me-20).¹³C-NMR(100MHz,Pyridine-d₅)δ_C:13.7(C-20),20.3(C-2),22.9(C-11),26.2(C-6),28.7(C-18),34.4(C-12),38.4(C-3),38.9(C-7),39.1(C-1),40.7(C-10),44.4(C-4),56.0(C-9),56.5(C-5),58.3(C-15),59.79(C-16),106.7(C-17),127.3(C-14),142.6(C-13),148.5(C-8),176.4(C-19),62.0(C-6′),70.8(C-4′),73.8(C-2′),78.9(C-3′),79.2(C-5′),95.5(C-1′)。

本發(fā)明中對(duì)上述對(duì)映半日花烷型二萜類化合物進(jìn)行體外經(jīng)典途徑和旁路途徑抗補(bǔ)體活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，結(jié)果表明所述化合物對(duì)經(jīng)典途徑的抑制作用(CH₅₀)為0.023-0.172mg/ml，對(duì)旁路途徑的抑制作用(AP₅₀)為0.054-0.296mg/ml，所述化合物(1-9)對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑和旁路途徑都有明顯的抑制作用。表1顯示了化合物1-9對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑的抑制作用效果(Mean±SD,n＝3))。

本發(fā)明的穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物可用于制備抗補(bǔ)體藥物，用于治療 由于補(bǔ)體系統(tǒng)非正常激活引發(fā)的疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性呼吸窘迫綜合癥、流感、非典等。

表1.

附圖說明

圖1.穿心蓮中對(duì)映半日花烷型二萜類化合物(1-9)的提取分離流程圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.活性導(dǎo)向分離制備二萜類抗補(bǔ)體活性化合物

穿心蓮藥材(市購)19kg，粉碎，用95％乙醇回流提取(30L×3次)，合并提取液并濃縮得浸膏980g，其中900g用水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到150g、280g、140g，通過體外溶血試驗(yàn)，確定活性部位為乙酸乙酯部位，經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(70:1-0:1)梯度洗脫，得到9個(gè)流份Fr.1-9。流份Fr.1用大孔樹脂D101分離，用乙醇:水(20％,40％,60％,80％,100％乙醇)依次洗脫，再經(jīng)過凝膠LH-20(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脫)及HPLC制備液相(42％甲醇/水)純化得到化合物2(6.8mg)、3(5.2mg)；流份Fr.3用硅膠柱以乙酸乙酯:甲醇(80:1-甲醇)梯度洗脫，再經(jīng)D101(40％，80％乙醇/水洗脫)分別得D1、D2流份，其中D1流份用硅膠柱以二氯甲烷/甲醇(10:1)洗脫及HPLC制備液相(48％甲醇/水)純化得到化合物4(21mg)，D2流份經(jīng) HPLC制備液相(36％乙腈/水)純化得到化合物5(8mg)、6(9mg)、7(5mg)；流份Fr.6經(jīng)ODSC₁₈柱以甲醇:水(1:4-9:1)進(jìn)行梯度洗脫，再經(jīng)LH-20凝膠柱(二氯甲烷:甲醇＝1:1洗脫)和HPLC制備液相(21％乙腈/水)進(jìn)行純化分離，得到化合物1(11mg)、8(13mg)、9(19mg)。

實(shí)施例2.體外抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑試驗(yàn)

取補(bǔ)體(豚鼠血清)0.1ml，取補(bǔ)體(豚鼠血清)0.1ml，加入巴比妥緩沖液(BBS)配制成1:10的溶液，用BBS對(duì)倍稀釋成1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280的補(bǔ)體溶液，取1:1000溶血素、0.2ml各濃度補(bǔ)體及2％羊紅細(xì)胞(SRBC)各0.1ml溶于0.2ml BBS中，混合均勻，37℃水浴30min后放入低溫高速離心機(jī)，在5000rpm、4℃條件下離心10min。分別取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm測(cè)定其吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組(0.1ml 2％SRBC溶于0.5ml三蒸水)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率；以補(bǔ)體稀釋度為X軸，溶血百分率為Y軸作圖；選擇達(dá)到相似溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度，取臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，加入適量BBS、溶血素和2％SRBC，37℃水浴30min后放入低溫高速離心機(jī)，5000rpm、4℃條件下離心10min后分別取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下測(cè)定吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置供試品對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組；將供試品吸光度值扣除相應(yīng)供試品對(duì)照組吸光度值后計(jì)算溶血率，以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計(jì)算50％抑制溶血所需供試品的濃度(CH₅₀)，結(jié)果如表1所示。

實(shí)施例3.體外抗補(bǔ)體旁路途徑試驗(yàn)

取補(bǔ)體(人血清)0.2ml，加入AP稀釋液(巴比妥緩沖液，pH＝7.4,含5mM Mg²⁺,8mM EGTA)配制成1:1的溶液，對(duì)倍稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128的溶液；取各濃度補(bǔ)體0.15ml、AP稀釋液0.15ml及0.5％兔紅細(xì)胞(RE)0.20ml，混勻，37℃水浴30min后置于低溫高速離心機(jī)，在5000rpm、4℃條件下離心10min，分別取每管上清0.2ml于96孔板，在405nm測(cè)定吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組(0.20ml 0.5％RE溶于0.3ml三蒸水)，以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率，以補(bǔ)體稀釋度為X軸，溶血百分率為Y軸作圖；選擇達(dá)到相似高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度，取確定的臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，于37℃預(yù)水浴10min后，加入0.2ml 0.5％RE，將每管37℃水浴30min后 置于低溫高速離心機(jī)，5000rpm、4℃條件下離心10min后，分別取每管上清0.2ml于96孔板，405nm下測(cè)定其吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置供試品對(duì)照組、補(bǔ)體組和全溶血組，將供試品吸光度值扣除相應(yīng)供試品對(duì)照組吸光度值后計(jì)算溶血率。以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計(jì)算50％抑制溶血所需供試品的濃度(AP₅₀)；結(jié)果如表1所示。

表1.化合物1-9對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑的抑制作用(Mean±SD,n＝3)