神經調節(jié)蛋白應用于人的安全劑量的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及對人體的安全給藥劑量，特別地，涉及神經調節(jié)蛋白應用于人時的安 全劑量。
【背景技術】
[0002] 神經調節(jié)蛋白（neuregulin，NRG ;heregulin，HRG)，又叫神經膠質生長因子 (glial growth factor，GGF)、neu 分化因子（new differentiation factor，NDF)，為分子 量在44KD左右的糖蛋白，它們在細胞間傳遞信號，是酪氨酸激酶受體ErbB家族的配體。神 經調節(jié)蛋白家族含 4 個成員：NRGl，NRG2，NRG3，NRG^(Fallsetal.，ExpCellRes.284: 14-30, 2003)對后三者的生物學功能相對來講知之甚少。NRGl在神經系統(tǒng)、心臟和乳腺中 起著重要作用，還有證據(jù)顯示NRGl信號傳遞在其他一些器官系統(tǒng)的發(fā)育、功能以及人類疾 ?。òň穹至寻Y和乳腺癌）的發(fā)病機理中起作用。NRGl有很多異構體。對基因突變小 鼠（基因敲除小鼠）的研宄說明在N末端區(qū)或表皮生長因子（EGF)類似區(qū)不同的異構體， 其在體功能也不一樣。本發(fā)明是以神經調節(jié)蛋白1β (NRGie)為基礎的。
[0003] 神經調節(jié)蛋白 1β 為一跨膜蛋白（Holmes et al.，Science 256,1205-1210， 1992)。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白類似區(qū)（Ig-Iikedomain)和EGF類似區(qū) (EGF-like domain)，膜內部分是C末端。在細胞外基質的金屬蛋白酶作用下，神經調節(jié)蛋 白的膜外部分可被酶切下來而呈游離狀態(tài)，從而有利于和周圍細胞表面的ErbB受體結合， 激活相應的細胞信號傳遞。
[0004] ErbB受體家族也分為四類，ErbBl、ErbB2、ErbB3和ErbB4,它們都是跨膜蛋白，分 子量在180-185KD附近。除ErbB2外，它們在膜外的N末端都含配體結合區(qū)；除ErbB3外， 它們在膜內的C末端都含蛋白酪氨酸激酶活性。其中ErbBl是表皮生長因子的受體，ErbB3 和ErbB4都是神經調節(jié)蛋白的受體。在神經調節(jié)蛋白的受體中，只有ErbB2和ErbB4在心 臟表達量較高。（Yarden et al·，Nat Rev Mol Cell Biol，2:127-137,2001)
[0005] 當神經調節(jié)蛋白與ErbB3或ErbB4的膜外部分結合時，將引起ErbB3、ErbB4與其 他ErbB受體（常常包括ErbB2)形成異源二聚體，或ErbB4自身形成同源二聚體，然后導致 受體的膜內部分被磷酸化（Yarden et al.，Nat Rev Mol Cell Biol，2:127-137,2001)。磷 酸化的膜內部分可進一步與細胞內的多種信號傳遞蛋白結合，從而激活下游ERK或AKT信 號通路，引起一系列細胞反應：包括刺激或抑制細胞增殖、細胞凋亡、細胞迀移、細胞分化或 細胞粘連。
[0006] 神經調節(jié)蛋白對心臟的發(fā)育尤其重要（W00037095, CN1276381，W003099300， W09426298, US 6444642, WO 9918976, WO 0064400, Zhao et al. , J. Biol. Chem. 273, 10261-10269,1998)。在胚胎發(fā)育早期，神經調節(jié)蛋白的表達主要局限于心內膜，隨后通過 旁分泌途徑釋放到周圍心肌細胞并與細胞膜上的蛋白酪氨酸激酶受體ErbB4膜外部分結 合，ErbB4進而與ErbB2形成異源二聚體。ErbB4/ErbB2復合物的形成及激活對早期海綿樣 心臟形成小梁是必須的。神經調節(jié)蛋白、ErbB4和ErbB2三個蛋白基因中的任何一個缺失 都會使胚胎沒有小梁并在發(fā)育早期死于子宮。W00037095顯示一定濃度的神經調節(jié)蛋白可 持續(xù)激活ERK信號通路，促進心肌細胞的生長及分化，引導心肌細胞和細胞粘連處肌節(jié)和 細胞骨架的重建，改善心肌細胞的結構，增強心肌細胞的收縮。W00037095及W003099300還 指出神經調節(jié)蛋白可用于檢測、診斷和治療各種心血管疾病。
[0007] 下面列舉了與本發(fā)明有關的一些現(xiàn)有技術文獻：
[0008] 1、Cardiac muscle function and manipulation，W00037095
[0009] 2、生長因子神經調節(jié)蛋白及其類似物的新應用，CN1276381
[0010] 3、Neuregulin based methods and compositions for treating cardiovascular diseases，W003099300
[0011] 4、You-yang Zhao, Douglas R. Sawyer，Ragavendra R. Baliga，Douglas J. Opel? Xinqiang Han，Mark A. Marchionni，and Ralph A. Neuregulins Promote Survival and Growth of Cardiac Myocytes. Kelly J. Biol.Chem. 273,10261-10269(1998)
[0012] 5、Methods for treating muscle diseases and disorders，W09426298
[0013] 6、Methods of increasing myotube formation or survival or muscle cell mitogenesis，differentiation or survival using a neuregulin，US 6444642
[0014] 7、Therapeutic methods comprising use of a neuregulin，WO 9918976
[0015] 8、Methods for treating congestive heart failure，WO 0064400
[0016] 9、William E. Holmes，Mark X. Sliwkowski，Robert W. Akita，William J. Henzel， James Lee，John W. Park，Daniel Yansura，Nasrin Abadi，Helga Raab，Gail D.Lewis， H. Michael Shepard，Wun-Jing Kuang，William I. Wood，David V. Goeddel，Richard L. Wandlen. Identification of heregulin，a specific activator of pl85 (erbB2). Science 256,1205-1210(1992)
[0017] 10、Douglas L. Falls.Neuregulins :functions，forms，and signaling strategies. Experimental Cell Research 284?14-30 (2003)
[0018] 11、 Yosef Yarden， Mark X.Sliwkowski.Untangling the ErbB signalling Network. Nature Reviews :Molecular Cell Biology 2127-137(2001)。
[0019] 我們已經發(fā)現(xiàn)給心衰大鼠連續(xù)數(shù)次注射一定量（149. 3U/kg :蛋白量/體重）的神 經調節(jié)蛋白能激活其體內的ERK和AKT信號通路，并有利于心力衰竭的恢復。
[0020] 為了找到用神經調節(jié)蛋白治療人心臟病的有效、安全劑量，需要先對健康人做毒 理實驗，找到對健康人無毒負作用的安全劑量。本發(fā)明通過大量實驗和分析，發(fā)現(xiàn)了神經調 節(jié)蛋白應用于人的安全劑量，滿足了此種需要。
[0021] 發(fā)明概述
[0022] 本發(fā)明提供了神經調節(jié)蛋白應用于人時的安全劑量。在本發(fā)明的一種實施方案 中，所述的安全劑量是將神經調節(jié)蛋白一次或多次施用給健康人群時，所獲得的健康人體 能承受的安全劑量。具體地，所述安全劑量在大約2. 99至大約35. 83U/kg (蛋白/體重）的 范圍內，例如大約 2. 99U/kg、大約 5. 97U/kg、大約 11. 94U/kg、大約 17. 92U/kg、大約 23. 89U/ kg或大約35. 83U/kg(蛋白/體重）。更優(yōu)選地，所述的安全劑量是在大約2. 99至大約 17. 92U/kg(蛋白/體重）的范圍內，例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11. 94U/kg或 大約17.92U/kg(蛋白/體重）。
[0023] 本發(fā)明還提供了對人體安全使用神經調節(jié)蛋白劑量的方法，其包括將一定劑量的 神經調節(jié)蛋白一次或多次施用給健康人群，而不會引起負反應或者只引起可以被接受程度 的負反應。其中，所述的劑量在大約2. 99至大約35. 83U/kg(蛋白/體重）的范圍內，例 如大約 2. 99U/kg、大約 5. 97U/kg、大約 11. 94U/kg、大約 17. 92U/kg、大約 23. 89/kg 或大約 35. 83U/kg (蛋白/體重）。更優(yōu)選地，所述的劑量是在大約2. 99至大約17. 92U/kg (蛋白/ 體重）的范圍內，例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11. 94U/kg或大約17. 92U/kg (蛋 白/體重）。在優(yōu)選的實施方案中，將在大約2. 99至大約17. 92U/kg(蛋白/體重）范圍內 例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11. 94U/kg或大約17. 92U/kg(蛋白/體重）的神 經調節(jié)蛋白一次或多次施用給健康人群，而不會引起負反應或者只引起可以被接受程度的 負反應?；蛘撸瑢⒊^17. 92U/kg至大約35. 83U/kg (蛋白/體重）范圍內例如大約23. 89/ kg或大約35. 83U/kg(蛋白/體重）的神經調節(jié)蛋白一次施用給健康人群，而不會引起負反 應或者只引起可以被接受程度的負反應。
[0024] 本發(fā)明還提供了對于人體為安全的藥物制劑，其中包含安全劑量的神經調節(jié)蛋 白。所述安全劑量在大約2. 99至大約35. 83U/kg (蛋白/體重）的范圍內，例如大約2. 99U/ kg、大約 5. 97U/kg、大約 IL 94U/kg、大約 17. 92U/kg、大約 23. 89/kg 或大約 35. 83U/kg (蛋 白/體重）。更優(yōu)選地，所述安全劑量是在大約2. 99至大約17. 92U/kg (蛋白/體重）的 范圍內，例如大約2. 99U/kg、大約5. 97U/kg、大約11.94U/kg或大約17. 92U/kg(蛋白/體 重）。
[0025] 附圖簡述
[0026] 圖1是受試者A302(35. 83U神經調節(jié)蛋白/kg體重）在給藥前的心電圖。
[0027] 圖2是受試者A302 (35. 83U神經調節(jié)蛋白/kg體重）在給藥后2小時的心電圖。
[0028] 圖3是受試者A302 (35. 83U神經調節(jié)蛋白/kg體重）在給藥后24小時的心電圖。
[0029] 圖4是受試者A302 (35. 83U神經調節(jié)蛋白/kg體重）在給藥7天后的心電圖。
[0030] 圖5是給藥17.92U/kg(神經調節(jié)蛋白/體重）組受試者C405在給藥前的心電圖。
[0031] 圖6是給藥17.92U/kg(神經調節(jié)蛋白/體重）組受試者C405在第一次給藥后24 小時的心電圖。
[0032] 圖7是給藥17. 92U μ g/kg(神經調節(jié)蛋白/體重）組受試者C405在第二次給藥 后2小時的心電圖。
[0033] 圖8是給藥17. 92U/