專利名稱：：用于治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病、編碼經(jīng)修飾的Mx蛋白的多核苷酸、所述經(jīng)修飾的Mx蛋...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及突變的Mx發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin),更具體地涉及利用此類Mx發(fā)動(dòng)蛋白突變體預(yù)防或治療與病毒感染相關(guān)的疾病的組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及用于治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病、編碼經(jīng)修飾的Mx蛋白的多核苷酸、所述經(jīng)修飾的Mx蛋白以及表達(dá)編碼經(jīng)修飾的Mx蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。背景產(chǎn)生了許多疫苗，并且驗(yàn)證了所述疫苗預(yù)防與人和動(dòng)物的病毒感染相關(guān)的癥狀和死亡率。由于被靶向的病毒的持續(xù)遺傳進(jìn)化，這些疫苗中的一些疫苗必須經(jīng)常更新，特別是目的在于預(yù)防可歸因于甲型流感病毒的癥狀和死亡率的那些疫苗。用于制備更新的疫苗的病毒株系的這樣的反復(fù)更新阻礙了大量疫苗的及時(shí)產(chǎn)生。此外，此類反復(fù)更新和確保此類疫苗的快速和廣泛分配及施用所必需的供應(yīng)鏈的生產(chǎn)成本通常阻止了豬、雞、火雞或馬工業(yè)及時(shí)充足地接種所有被靶向的動(dòng)物。在人中，僅金剛烷(金剛烷胺，金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶的抑制劑(奧司他韋，扎那米韋)可用于治療與甲型流感病毒相關(guān)的疾病。此類分子的大規(guī)模使用迅速導(dǎo)致抗性病毒株的出現(xiàn)。例如，大部分循環(huán)甲型流感病毒株目前抗金剛烷并且抗神經(jīng)氨酸酶的抑制劑的H5N1株的流行持續(xù)增加。因此，能夠緩和人的甲型流感病毒相關(guān)疾病的化學(xué)治療分子是非常缺乏的。在人中，提出了使用單克隆抗體來(lái)抵抗病毒疾病的。然而，由于此類分子包含非人區(qū)段，因此它們通常引起過(guò)敏反應(yīng)。此外，由于許多病毒被賦予用于逃避新型治療分子的非常有效的遺傳進(jìn)化能力，因此預(yù)期的來(lái)自開發(fā)新型抗病毒單克隆抗體的方法的成本/效益比明顯阻礙了新型分子的發(fā)現(xiàn)。在人中，基因療法是抵抗疾病的替代性方法，如過(guò)去對(duì)于遺傳疾病、癌癥或病毒疾病所顯示的方法(參見PCT公布號(hào)W091/02805、EPO415731和WO90/07936)。由于基因療法中使用的載體僅轉(zhuǎn)化一部分可用于病毒擴(kuò)增的宿主細(xì)胞，因此可靠的抗病毒轉(zhuǎn)基因必須編碼非常強(qiáng)的抗病毒蛋白以給基因療法提供降低被靶向的疾病的嚴(yán)重度的任何機(jī)會(huì)。此類可靠的轉(zhuǎn)基因仍未存在。在動(dòng)物中，經(jīng)濟(jì)破壞性或獸傳人獸互通性病毒性接觸傳染病的傳播的預(yù)防包括大規(guī)模屠殺。今天，該衛(wèi)生政策面臨重大經(jīng)濟(jì)和倫理考量。在動(dòng)物中，理論上仍然可能使用遺傳抗性親代(genitor)來(lái)在后代之間散播抗性性狀并且，因此，逐漸增強(qiáng)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物群體的流行病抗性。然而，該方法基于對(duì)編碼抗被靶向的疾病的先天抗性的基因座上的等位基因變異的先前鑒定。就成本/效益比而言這樣的項(xiàng)目是不現(xiàn)實(shí)的，特別地因?yàn)樵S多疾病抗性性狀是多基因的。在1962年，Lindenmann小組偶然發(fā)現(xiàn)近交小鼠品系A(chǔ)2G自發(fā)地抗利用對(duì)于其它品系是系統(tǒng)性致命的甲型流感病毒的實(shí)驗(yàn)感染。新型抗性性狀被記錄為Mx，代表粘病毒抗性(myxovirusresistance)。數(shù)年后發(fā)現(xiàn)，Mx+性狀在干擾素α/β(IFNα/β)治療后與約78kDa的蛋白質(zhì)(此后命名為Mx蛋白)的表達(dá)共分離。自那以來(lái)，分子遺傳學(xué)研究導(dǎo)致首先在小鼠中，然后在人中以及隨后在所有研究的脊椎動(dòng)物物種中鑒定了引起Mx蛋白表達(dá)的基因。根據(jù)序列同源性，已顯示脊椎動(dòng)物Mx蛋白為大的發(fā)動(dòng)蛋白樣GTP酶。發(fā)動(dòng)蛋白組成了在許多細(xì)胞過(guò)程(其中有遷移、膜重塑、胞吞、小泡運(yùn)輸以及細(xì)胞和細(xì)胞器的分裂)中起著至關(guān)重要的作用的高分子量GTP酶的亞家族。在發(fā)動(dòng)蛋白分子中，有一些不存在典型的普列克底物蛋白(pleckstrin)和富含脯氨酸/精氨酸的結(jié)構(gòu)域并且其表達(dá)受I型干擾素控制；此類蛋白稱為“Mx”發(fā)動(dòng)蛋白。每一個(gè)脊椎動(dòng)物物種具有2個(gè)或3個(gè)Mx基因，已在體外顯示其少數(shù)等位基因形式編碼被賦予抗病毒活性(最常見地是抗甲型流感病毒)的Mx發(fā)動(dòng)蛋白。其它研究顯示Mx發(fā)動(dòng)蛋白的一些形式被賦予抗病毒性質(zhì)以及靶向不同的病毒(取決于研究的Mx同種型)。定向誘變研究后來(lái)顯示Mx發(fā)動(dòng)蛋白的C末端GTP酶效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(GED)支持抗病毒活性和抗病毒譜。為了努力研究抗病毒活性，已獲得牛(BostaUrUS)Mxl發(fā)動(dòng)蛋白序列。利用表達(dá)牛Mxl基因的培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行的體外測(cè)試顯示人和牛副流感_3、人和牛呼吸道合胞體、牛病毒性腹瀉/粘膜疾病、仙臺(tái)、麻疹和腦心肌炎病毒不被牛Mxl抑制，而水泡性口炎和狂犬病病毒被其抑制。與其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白相比較，特定的抗病毒譜因而與牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)，但由于現(xiàn)有技術(shù)已顯示其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白展示特定的抗病毒譜，這并非是意料之外的。除由小鼠Mxl+等位基因編碼的是個(gè)明顯的例外外，現(xiàn)有技術(shù)缺乏能夠在體內(nèi)抑制甲型流感病毒感染相關(guān)疾病的Mx發(fā)動(dòng)蛋白。由于甲型流感病毒在人、豬和家禽群體中持續(xù)地循環(huán)，所以人、豬或雞Mx蛋白不分別保護(hù)人、豬和雞免受嚴(yán)重的、甚至致命的流感疾病的侵害并不令人驚奇。因此將人、豬或雞抗病毒Mxl發(fā)動(dòng)蛋白用于基因療法并不可行。類似地，選擇被賦予最佳等位基因(如體外測(cè)定的)的親代來(lái)逐漸產(chǎn)生更具抗性的雞或豬群體也不可行。相反地，將小鼠Mxl發(fā)動(dòng)蛋白用于基因療法或用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗流感食用動(dòng)物(foodanimal)在理論上是可行的。然而，由于小鼠Mxl發(fā)動(dòng)蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上遠(yuǎn)離人Mx蛋白，因此免疫病理學(xué)(過(guò)敏)問(wèn)題可能因基于小鼠Mxl的基因療法或因含小鼠Mxl的食品的攝入而產(chǎn)生。此外，將鼠源化(murinized)雞肉、鼠源化火雞肉或鼠源化豬肉擺上市場(chǎng)無(wú)疑將引起消費(fèi)者的反感。因此，高度期望將具有增強(qiáng)的抗病毒活性的突變型人Mx發(fā)動(dòng)蛋白用于基因治療組合物。類似地，高度期望產(chǎn)生具有等于或優(yōu)于由小鼠Mxl在體內(nèi)產(chǎn)生的抗病毒活性的突變型食用動(dòng)物Mx發(fā)動(dòng)蛋白，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗流感食用動(dòng)物。迄今已知的所有抗流感Mx發(fā)動(dòng)蛋白的抗病毒功能都是通過(guò)它們的C末端GTP酶效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(GED)產(chǎn)生的。TNF-受體相關(guān)因子(TRAF)形成許多銜接分子(adaptermolecule),在TNF-、IL-Iβ,TLR和RANK受體通過(guò)它們各自的同源配體銜接后，所述銜接分子首先與激活的受體接觸，用作激酶和被招募至激活的受體的其它效應(yīng)蛋白的?？糠肿印RAF隨后調(diào)節(jié)受體-配體復(fù)合物的亞細(xì)胞再定位并且通過(guò)控制途徑中的關(guān)鍵蛋白的降解來(lái)調(diào)節(jié)應(yīng)答的性質(zhì)和程度。通過(guò)這樣的作用，TRAF控制蛋白激酶級(jí)聯(lián)以及NF-kB和AP-I家族的轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而調(diào)諧參與增殖、分化和細(xì)胞凋亡的眾多基因的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)有技術(shù)缺乏抑制病毒增殖和/或消除或減弱病毒疾病相關(guān)的細(xì)胞因子應(yīng)答和器官功能障礙的方法。因此本發(fā)明的目的是提供動(dòng)物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述動(dòng)物具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性。目的還在于提供用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的藥物。此外，本發(fā)明的目的因而也在于提供用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒，特別是用于人用途的藥物。發(fā)明概述在根據(jù)本發(fā)明的研究中，令人驚訝地已發(fā)現(xiàn)在體外，與其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白相比較，牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白展示出曾經(jīng)鑒定的最強(qiáng)的抗甲型流感病毒活性。此外，由該特定Mx發(fā)動(dòng)蛋白產(chǎn)生的特別強(qiáng)的抗甲型流感病毒活性在體內(nèi)得到了確認(rèn)，從而提供了用于預(yù)防或治療甲型流感病毒相關(guān)疾病的最可靠的分子。如根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所預(yù)期的，有人假設(shè)該前所未有的抗病毒活性由蛋白質(zhì)的C末端區(qū)段、所謂的GED支持。然而，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，用被賦予弱抗甲型流感病毒活性的任何Mx發(fā)動(dòng)蛋白的GED置換牛Mxl中的GED導(dǎo)致仍然被賦予上述罕見抗病毒活性的嵌合Mx發(fā)動(dòng)蛋白。相反地，將牛GED移植在弱抗流感Mx發(fā)動(dòng)蛋白的骨架上導(dǎo)致仍然弱抗流感嵌合Mx發(fā)動(dòng)蛋白。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了未被插入在C末端GED區(qū)段中的Mx抗病毒活性增強(qiáng)子，從而提供了不依賴于GED的抗病毒基序。該不依賴于GED的抗病毒基序由經(jīng)鑒定存在于牛、綿羊(Ovisaries)和印度水牛(Bubalusbubalis)的Mxl骨架中的TRAF2和TRAF6結(jié)合基序(其不存在于迄今已測(cè)試的所有脊椎動(dòng)物Mx發(fā)動(dòng)蛋白中)代表。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)具有該新型TRAF2/TRAF6結(jié)合基序的Mx發(fā)動(dòng)蛋白有效地結(jié)合TRAF2和TRAF6，然而不存在該新型TRAF2/TRAF6結(jié)合基序的Mx發(fā)動(dòng)蛋白則不結(jié)合。此外，在本發(fā)明的研究過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)該新型TRAF2/TRAF6結(jié)合基序在Mx骨架中的存在足以驅(qū)動(dòng)上述前所未有的抗甲型流感活性。支持這些發(fā)現(xiàn)的是，TRAF2/TRAF6結(jié)合基序缺陷型突變牛Mxl顯示極弱的抗甲型流感病毒活性。因此，本發(fā)明顯示TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx發(fā)動(dòng)蛋白中的插入足以增強(qiáng)其抗甲型流感活性。本發(fā)明人進(jìn)行了牛Mxl蛋白的序列與其在例如雞、火雞、鴨、豬、馬和人中的對(duì)應(yīng)蛋白的序列比較，該比較顯示這類Mxl蛋白不具有上述基序。本發(fā)明因而提供了基于這些發(fā)現(xiàn)的用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒的新型藥物。本發(fā)明從而提供了用于預(yù)防性和/或治療性治療哺乳動(dòng)物的甲型流感病毒引發(fā)的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Mx蛋白的基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N末端GTP酶結(jié)構(gòu)域與N末端GTP酶效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(GED)之間的中間結(jié)構(gòu)域中。更優(yōu)選，所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于所述Mx蛋白的氨基酸序列的氨基酸位點(diǎn)300與450之間。更優(yōu)選的所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE(SEQIDNO:9)在牛Mxl蛋白中的位置的位置，或位于所述相應(yīng)位置的上游或下游至多20個(gè)氨基酸殘基的位置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置的上游或下游至多15、10、5、4、3、2、I個(gè)氨基酸殘基。然而，最優(yōu)選地，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白的位置的位置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由Mxl蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由人Mxl(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff(SEQIDNO:1)或P-X-Q/E-E(SEQIDNO:2)，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D(SEQIDNO3)代表。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D(SEQIDNO:4)代表并且TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W(SEQIDNO5)代表。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由Ρ_Χ-Ε-Χ-Χ_Ε(SEQIDNO6),優(yōu)選由P-X-E-E-X-E(SEQIDNO-J),更優(yōu)選由P-E-E-E-X-E(SEQIDNO8),最優(yōu)選由P-E-E-E-S-E(SEQIDNO9)代表。在可選擇的實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列SEQIDNOs26-77之任一項(xiàng)代表。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸用于預(yù)防性和/或治療性治療人的甲型流感病毒誘發(fā)的疾病；為了該目的，優(yōu)選地使用包含編碼具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Mx蛋白的基因的多核苷酸，其中除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由人Mxl(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在人Mxl蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置。例如，人MxA蛋白的氨基酸序列PEDENE(SEQIDNO:10)(其在人MxA蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE(SEQIDNO9)在牛Mxl蛋白中的位置的位置)可經(jīng)修飾來(lái)提供TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如P-E-E-E-N-E(SEQIDNO:11)或P-E-E-E-S-E(SEQIDNO9)。更優(yōu)選地，多核苷酸編碼具有圖15中顯示的氨基酸序列(SEQIDNO17)的蛋白質(zhì)，其代表人MxA，其中序列PEDENE被PEEESE替代?？赏ㄟ^(guò)下文中進(jìn)一步描述的序列比對(duì)確定給定的Mx蛋白中相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置。在可選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，將藥物進(jìn)行改造以適用于動(dòng)物用途，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由Mx蛋白(優(yōu)選除牛Mxl以外的)代表,更優(yōu)選地，由待治療的相同動(dòng)物的天然存在的Mxl或Mx2蛋白代表。優(yōu)選地，為了用于預(yù)防性和/或治療性治療原雞屬(雞)、火雞屬(火雞)、鴨科(鴨、鵝)、豬屬(豬)和馬屬(馬)的甲型流感病毒誘發(fā)的疾病，本發(fā)明還提供了多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼Mx蛋白的基因，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置，或位于所述相應(yīng)位置的上游或下游至多20個(gè)氨基酸殘基的位置，并且其中取決于待治療的動(dòng)物，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由相應(yīng)的原雞屬(雞)、火雞屬(火雞)、鴨科(鴨、鵝)、豬屬(豬)和馬屬(馬)Mx蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防性和/或治療性治療斑鱒屬(鮭魚)的感染性鮭魚貧血病毒(正粘病毒)誘發(fā)的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼Mx蛋白的基因，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置或位于所述相應(yīng)位置的上游或下游至多20個(gè)氨基酸殘基的位置，并且其中除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由斑鱒屬M(fèi)x蛋白，優(yōu)選斑鱒屬M(fèi)xl或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。本發(fā)明還提供了用于動(dòng)物用途的藥物的可選擇的實(shí)施方案用于預(yù)防性和/或治療性治療包含編碼牛、綿羊或非洲羚羊?qū)?bubaline)的Mxl蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物的基因的原雞屬(雞)、火雞屬(火雞)、鴨科(鴨、鵝)、豬屬(豬)和馬屬(馬)中的甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多核苷酸。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有6至50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff或P-X-Q/E-E，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D的肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是P-X-E-X-X-E，更優(yōu)選為P-X-E-E-X-E，更優(yōu)選為P-E-E-E-X-E和最優(yōu)選為P-E-E-E-S-E。通過(guò)基因療法將用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的本發(fā)明的多核苷酸遞送入需要這樣的治療的個(gè)體。因此，本發(fā)明還提供了作為基因療法的工具的包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，所述基因療法用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病。本發(fā)明還提供了由上述本發(fā)明的多核苷酸編碼的用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多肽或肽。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了用于預(yù)防必和/或治療性治療人的甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多肽，其中所述多肽為Mx蛋白，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置或位于所述相應(yīng)的位置的上游或下游至多20個(gè)氨基酸殘基的位置，并且其中除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由人MxI(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。多肽的更優(yōu)選實(shí)施方案為上文中概括的實(shí)施方案。本發(fā)明還提供了用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的肽，其中所述肽具有6至50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度，并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E。在優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/Ε-Χ-Χ-Ε/D/Y/F/ff是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是Ρ-Χ-Ε-Χ-Χ-Ε，更優(yōu)選是Ρ-Χ-Ε-Ε-Χ-Ε，更優(yōu)選是P-E-E-E-X-E，最優(yōu)選是P-E-E-E-S-E。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，肽具有10至40個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。本發(fā)明還提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性，包含編碼具有6至50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E的肽的多核苷酸作為表達(dá)的轉(zhuǎn)基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是Ρ_Χ-Ε-Χ-Χ_Ε，更優(yōu)選是P-X-E-E-X-E,更優(yōu)選是P-E-E-E-X-E,最優(yōu)選是P-E-E-E-S-E。本發(fā)明還提供了非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性，其表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中任選地條件是所述動(dòng)物不屬于靈長(zhǎng)目、牛科(牛屬、印度水牛、Ovis)、鰭腳目或嚙齒目的分類組。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)選實(shí)施方案中，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列不為牛Mxl蛋白并且優(yōu)選與牛Mxl蛋白具有低于95%的同一'丨生,更優(yōu)選低于90%的同一性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N末端GTP酶結(jié)構(gòu)域與N末端GTP酶效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(GED)之間的中間結(jié)構(gòu)域中。更優(yōu)選地，所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于所述Mx蛋白的氨基酸序列的氨基酸位點(diǎn)300與450之間。更優(yōu)選的所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置或位于所述相應(yīng)位置的上游或下游至多20個(gè)氨基酸殘基的位置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置的上游或下游至多15、10、5、4、3、2、I個(gè)氨基酸殘基。然而，最優(yōu)選TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括如下步驟引入編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或?qū)RAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域引入編碼Mx蛋白的內(nèi)源基因；其中所得的動(dòng)物表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中任選地條件是所述動(dòng)物不屬于靈長(zhǎng)目、?？?牛屬、印度水牛、Ovis)、鰭腳目或嚙齒目的分類組。在優(yōu)選方法中，所得的動(dòng)物表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，其中所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N末端GTP酶結(jié)構(gòu)域與N末端GTP酶效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(GED)之間的中間結(jié)構(gòu)域中。在更優(yōu)選方法中，所得的動(dòng)物表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，其中所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于所述Mx蛋白的氨基酸序列的氨基酸位點(diǎn)300與450之間。在更優(yōu)選方法中，所得的動(dòng)物表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，其中所述TRAF2和/或所述TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置或位于所述相應(yīng)的位置的上游或下游至多20個(gè)氨基酸殘基的位置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的上游或下游至多15、10、5、4、3、2、1個(gè)氨基酸殘基。然而，最優(yōu)選地，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域在Mx蛋白中位于相應(yīng)于六肽PEEESE在牛Mxl蛋白中的位置的位置。在動(dòng)物或用于其產(chǎn)生的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼所述Mx蛋白的基因?yàn)閮?nèi)源Mx基因或引入的轉(zhuǎn)基因。在動(dòng)物的內(nèi)源Mx基因被修飾的情況下，該基因仍然存在于其在染色體的原始位置上。優(yōu)選地，僅在相應(yīng)于牛Mxl基因的P-E-E-E-S-E基序的位置上對(duì)內(nèi)源Mx基因進(jìn)行修飾，以這樣的方式修飾該位置提供TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選，待修飾的內(nèi)源基因是各動(dòng)物的Mxl基因?？赏ㄟ^(guò)下文中進(jìn)一步描述的序列比對(duì)確定不同Mx蛋白中相應(yīng)于牛Mxl蛋白的六肽PEEESE的位置?；蛘撸瑸榱水a(chǎn)生具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可引入編碼Mx蛋白的轉(zhuǎn)基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域。適當(dāng)?shù)幕驗(yàn)榕；蚓d羊(綿羊)的天然存在的Mxl基因，其具有TRAF2/TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域P-E-E-E-S-E。然而，其它Mx基因可用作來(lái)自待修飾的物種或來(lái)自其它物種的Mx骨架(Mxl、Mx2或Mx3)，以構(gòu)建待在動(dòng)物中表達(dá)的人工Mx轉(zhuǎn)基因，只要Mx轉(zhuǎn)基因具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選在相應(yīng)于牛Mxl基因的P-E-E-E-S-E基序的位置)?？赏ㄟ^(guò)如下文中進(jìn)一步描述的序列比對(duì)確定不同Mx蛋白中相應(yīng)于牛Mxl蛋白的六肽PEEESE的位置。在可選擇的實(shí)施方案中，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列不是牛Mxl蛋白并且優(yōu)選地與牛Mxl蛋白具有低于95%的同一性，更優(yōu)選低于90%的同一性。·更優(yōu)選地，動(dòng)物選自原雞屬(雞)、火雞屬(火雞)、鴨科(鴨、鵝)、豬屬(豬)、馬屬(馬)和斑鱒屬(鮭魚)。在動(dòng)物或用于其產(chǎn)生的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff或P-X-Q/E-E，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D代表。此外，優(yōu)選地TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D代表并且TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W代表。更優(yōu)選地，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由P-X-E-X-X-E，優(yōu)選由P-X-E-E-X-E，更優(yōu)選由P-E-E-E-X-E，最優(yōu)選由P-E-E-E-S-E代表。在動(dòng)物或用于其產(chǎn)生的方法的可選擇的實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列SEQIDNOs:26-77之任一項(xiàng)代表。更優(yōu)選地，除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白的序列由Mxl蛋白代表。除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mxl蛋白的這些序列可由來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物物種或待修飾的動(dòng)物物種的現(xiàn)有Mxl的各自序列代表，或可由來(lái)自另一物種例如?；蚓d羊的Mxl蛋白代表，或可以是不同物種的嵌合Mxl蛋白。本發(fā)明還提供了將非肽測(cè)試化合物鑒定為用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的候選化合物的方法，包括在所述測(cè)試化合物存在或不存在的情況下檢查TRAF2和/或TRAF6對(duì)權(quán)利要求11中定義的多肽或肽的結(jié)合的步驟，其中在所述測(cè)試化合物存在的情況下減少的結(jié)合表示所述測(cè)試化合物能夠抑制甲型流感病毒的生命周期，從而適合作為用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的候選化合物。在優(yōu)選方法中，多肽用于檢查其對(duì)TRAF2和/或TRAF6的結(jié)合，所述多肽由Mx蛋白代表，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E代表。在優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/1/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是P-X-E-X-X-E，更優(yōu)選是Ρ-Χ-Ε-Ε-Χ-Ε，更優(yōu)選是Ρ-Ε-Ε-Ε-Χ-Ε，最優(yōu)選是P-E-E-E-S-E。在方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，肽用于檢查其對(duì)TRAF2和/或TRAF6的結(jié)合，所述肽具有6至50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W,優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E。在優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/ff是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是Ρ-Χ-Ε-Χ-Χ-Ε，更優(yōu)選是Ρ-Χ-Ε-Ε-Χ-Ε，更優(yōu)選是P-E-E-E-X-E，最優(yōu)選是P-E-E-E-S-E。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，肽具有10至40個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。定義術(shù)語(yǔ)“Μχ發(fā)動(dòng)蛋白”與術(shù)語(yǔ)“Μχ蛋白”可等同使用。術(shù)語(yǔ)“ΜχΑ”等同于人Mxl。氨基酸序列中例如P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W中的術(shù)語(yǔ)“X”是指任何天然存在的氨基酸殘基甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸。符號(hào)“/”表示相同位置上可選擇的氨基酸殘基。例如，“Q/E”表示TRAF2/6結(jié)合基序的Ptl中的氨基酸位置可以是“Q”(Gln，谷氨酰胺)或“E”(Glu，谷氨酸)。這些結(jié)合基序和它們的位置的定義示于圖9中。現(xiàn)有技術(shù)缺乏被賦予不依賴于GED的抗病毒基序的抗病毒Mx發(fā)動(dòng)蛋白。這樣的不依賴于GED的抗病毒基序的提供被認(rèn)為是非常有用的，因?yàn)榭僧a(chǎn)生組合兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，從而顯示增強(qiáng)的抗病毒活性的突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了本領(lǐng)域的該長(zhǎng)期需要和期望。可將本文公開的活性增強(qiáng)子插入任何Mx發(fā)動(dòng)蛋白骨架中以增強(qiáng)其抗病毒活性。本文公開的肽類Mx抗病毒活性增強(qiáng)子以對(duì)于甲型流感病毒有害的方式改變TRAF的生物學(xué)，這樣，本發(fā)明將用作人或動(dòng)物的病毒性疾病的新型預(yù)防劑或治療劑。Mx發(fā)動(dòng)蛋白是在脊椎動(dòng)物物種中用于許多病毒的先天抑制的至關(guān)重要的效應(yīng)蛋白。本發(fā)明開發(fā)了新型多肽在插入至Mx發(fā)動(dòng)蛋白骨架中之后可顯著地增強(qiáng)其抗病毒功能。下文中顯示的結(jié)果表明只有具有插入的新肽的突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合TNF受體相關(guān)因子2和6(TRAF2和TRAF6)。這些數(shù)據(jù)表明突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白對(duì)TRAF2和/或TRAF6的結(jié)合可證明作為人或動(dòng)物的病毒性疾病的預(yù)防劑或治療劑是有用的。本發(fā)明提供了增強(qiáng)由Mx發(fā)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的抗病毒活性的肽，其中所述肽包含功能性TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且被插入在Mx發(fā)動(dòng)蛋白骨架中。本發(fā)明還涉及使用本文中公開的肽抑制病毒的方法。此外，本發(fā)明還涉及使用本文中公開的肽或使用模擬由本文中公開的突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白賦予的抗病毒活性的非肽類似物改變TRAF2和/或TRAF6的功能的方法。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了鑒定能夠抑制TRAF2和/或TRAF6-依賴性機(jī)制的肽或非肽抗病毒分子的方法，包括步驟制備包含TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽，或制備包含TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白，和在肽或非肽分子存在或不存在的情況下檢查TRAF2和/或TRAF6對(duì)所述肽或突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白的結(jié)合，其中在所述非肽分子存在的情況下減少的結(jié)合表示所述非肽分子能夠抑制病毒。根據(jù)下列本發(fā)明的目前優(yōu)選的實(shí)施方案的描述，本發(fā)明的大多數(shù)方面、特征和有利方面將變得顯而易見。發(fā)明詳述附圖概述圖I顯示流感病毒A/H7/N7/雞的繁殖被牛Mxl蛋白(boMxl)抑制。用流感病毒A/H7N7感染誘導(dǎo)的(黑框)和非誘導(dǎo)的(白框)雙轉(zhuǎn)基因Vero細(xì)胞(V103)的匯合物，進(jìn)行48小時(shí)。將培養(yǎng)物上清液中的病毒滴度作圖。TCID5tl:50%的組織培養(yǎng)物感染劑量。值為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD。圖2顯不流感病毒H5N1的繁殖被牛Mxl(boMxl)、豬Mxl(poMxl)和人MxA(huMxA)蛋白抑制。用流感病毒A/H5N1感染誘導(dǎo)的(黑框)和非誘導(dǎo)的(白框)雙轉(zhuǎn)基因Veix)細(xì)胞(V103)的匯合物，進(jìn)行48小時(shí)。將培養(yǎng)物上清液中的病毒滴度作圖。TCID5tl:50%的組織培養(yǎng)物感染劑量。值為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD。圖3顯不在分別來(lái)源于表達(dá)同基因型(congenic)moMxl的純合BALB/c_A2G和表達(dá)boMxl的轉(zhuǎn)基因ML555和ML549小鼠品系的胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中流感病毒H5N1的繁殖被小鼠Mxl(moMxl)和牛Mxl(boMxl)抑制。FVB/J具有基因型Mxl+，BALB/c_A2G具有Mxl+/+。FVB/J-ML555為表達(dá)低水平的boMxl的小鼠細(xì)胞系，F(xiàn)VB/J-ML549為表達(dá)高水平的boMxl的小鼠細(xì)胞系。用流感病毒A/H5N1感染誘導(dǎo)的(黑框)和非誘導(dǎo)的(白框)細(xì)胞的匯合物，進(jìn)行48小時(shí)。將培養(yǎng)物上清液中的病毒滴度作圖。TCID5tl:50%的組織培養(yǎng)感染劑量。值為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SD。圖4顯示了牛Mxl的表達(dá)在體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn)室小鼠(野生型FVB/J或表達(dá)牛Mxl的ML-549品系的轉(zhuǎn)基因小鼠)的由甲型流感病毒H5N1感染引起的組織學(xué)改變。該圖顯示了多聚甲醛固定、石蠟包埋的各個(gè)小鼠的肺。用蘇木精和伊紅對(duì)5微米切片染色。野生型FVB/J小鼠的尸體解剖顯示碩大的、無(wú)搶發(fā)音的(noncrepitant)和擴(kuò)散的梅灰色(pink-grayish)的肺,這表示具有大規(guī)模肺水腫的充血的診斷。相反地,來(lái)自表達(dá)boMxl的小鼠的肺與在無(wú)特定病原體的FVB/J健康小鼠中取樣的肺相比較未顯示任何改變。在組織學(xué)上，來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠的肺與來(lái)自健康小鼠的肺相似。圖5顯示了Kaplan-Meyer存活分析。在第O天用40000TCID50的甲型流感病毒H5N1株鼻內(nèi)接種小鼠。BALB/C-A2G的基因型為Mxl+/+。小鼠品系FVB/J具有基因型Mxl+。小鼠FVB/J-ML555、FVB/J-ML549分別以低和高水平表達(dá)牛Mxl。圖6顯示了在用H5N1鼻內(nèi)接種后不同小鼠品系的體重減輕或體重增長(zhǎng)的百分比。圖7顯示了表達(dá)牛Mxl的小鼠(FVB/J-ML555和FVB/J-ML549)在用H5N1病毒株進(jìn)行鼻內(nèi)接種后具有比表達(dá)鼠Mxl的小鼠(BALB/C-A2G)低的肺病毒載量。圖8顯示了牛Mxl的N末端區(qū)段產(chǎn)生人和牛MxGED的抗流感活性。產(chǎn)生了具有人Mxl的N端和牛C端(GED結(jié)構(gòu)域)的嵌合Mxl蛋白huN/GEDbo;具有牛Mxl的N端和人C端(GED結(jié)構(gòu)域)的嵌合Mxl蛋白boN/GEDhu。boN/GEDbo定義野生型牛Mxl，huN/GEDhu定義野生型人Mxl(MxA)。用編碼各個(gè)構(gòu)建體的DNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，檢查細(xì)胞的Mx蛋白和流感核蛋白(NP)。該圖顯示了NP(流感核蛋白)-陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。Dox-是指不表達(dá)各Mx-構(gòu)建體的非誘導(dǎo)細(xì)胞，而Dox+是指表達(dá)各Mx構(gòu)建體的誘導(dǎo)的細(xì)胞。結(jié)果顯示牛Mxl的N末端區(qū)段顯著增強(qiáng)GED依賴性抗流感活性。圖9總結(jié)了具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同蛋白質(zhì)的序列比較。存在于牛、綿羊和印度水牛的Mxl發(fā)動(dòng)蛋白的N末端區(qū)段中的獨(dú)特六肽“PEEESE”(Pro-Glu-Glu-Glu-Ser-Glu；SEQIDNO:9)不存在于迄今已測(cè)序的所有其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白中。由于該反芻動(dòng)物特異性六肽同時(shí)具有共有TRAF2結(jié)合基序pX(Q/E)E(SEQIDNO2)和共有TRAF6結(jié)合基序pXEXX(Ar/Ac)(SEQIDNO:12)，因此假定該六肽具有TRAF2和-TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能。圖9A:Ρ_2、Ρ0和Pl位置上的序列和結(jié)構(gòu)保守界定了大TRAF2結(jié)合基序。這些位置被共有序列PX(Q/E)E(SEQIDNO2)占據(jù)，其中p(Pro，脯氨酸)以小寫體顯示，因?yàn)槠淇杀黄渌械却笮》菢O性殘基(Ser、Thr、CyS、Ile)置換，x表示任意殘基。P_2、Pc^PP3位置上的序列和結(jié)構(gòu)保守界定了小TRAF2結(jié)合基序。這些位置被共有序列px(Q/E)xxD(SEQIDN04)占據(jù)，其中Pro以小寫體顯示，因?yàn)槠淇杀黄渌械却笮》菢O性殘基(Ser、Thr、Cys、He)置換，X表示任意殘基。圖9B:顯示了TRAF6結(jié)合基序的共有序列。TRAF6結(jié)合基序的共有序列從位置-2(P_2)延伸至P3并且由pXEXX(Ar/Ac)(SEQIDNO12)組成，其中p(Pro，脯氨酸)以小寫體書寫以表示對(duì)其它小至中等大小的殘基(例如，Ala、Ser,Thr,He)的耐受性，x可以為任意殘基，Ar表示任何芳香殘基，Ac表示任何酸性殘基。圖10顯示了牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白(boMxl)結(jié)合TRAF2，而缺乏PEEESE的Mx發(fā)動(dòng)蛋白不結(jié)合。將野生型、表達(dá)huMxA的VA8、表達(dá)poMxl的VSK6和表達(dá)boMxl的V103細(xì)胞系與媒介物或與IFN-α/多西環(huán)素接觸。向細(xì)胞裂解物中添加抗-TRAF2mAB以進(jìn)行內(nèi)源免疫沉淀。利用SDS-PAGE分離免疫沉淀的復(fù)合物，利用多克隆兔抗-huMxA和抗-boMxl抗血清的混合物進(jìn)行印跡。利用綴合有HRP的豬抗-兔IgGF(ab')2片段顯示免疫復(fù)合物，利用CN/DABSubstrate試劑盒進(jìn)行過(guò)氧化物酶檢測(cè)。已重現(xiàn)性地從誘導(dǎo)的V103細(xì)胞(表達(dá)boMxl)、但未從誘導(dǎo)的表達(dá)人MxA-(VA8)、豬Mxl_(VSK6)或黑長(zhǎng)尾猴Mx(野生型Vero細(xì)胞)的Vero細(xì)胞系回收到對(duì)應(yīng)于boMxl的具有75kDa表觀分子量的條帶。這顯示TRAF2有效地結(jié)合boMxl但不結(jié)合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。圖11顯示了boMxl發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合TRAF6而缺乏PEEESE的Mx發(fā)動(dòng)蛋白不結(jié)合。產(chǎn)生了抑制TRAF2和TRAF6結(jié)合基序的boMxl發(fā)動(dòng)蛋白DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體具有兩個(gè)單點(diǎn)突變(E356D和S358N:分別在TRAF2/TRAF6共有序列的位置Ptl和P2上)。產(chǎn)生在與多西環(huán)素接觸后穩(wěn)定地表達(dá)該構(gòu)建體的VeiO細(xì)胞克隆以產(chǎn)生攜帶PEEESE缺陷基序的表達(dá)Mx的克隆(V103mut)。培養(yǎng)表達(dá)黑長(zhǎng)尾猴Mx的、表達(dá)人MxA的VA8、表達(dá)豬Mxl、表達(dá)牛Mxl的V103以及表達(dá)新的PEEESE缺陷突變型boMxl的V103mutVero細(xì)胞系，隨后將其與媒介物或IFN-α或多西環(huán)素接觸。除了為了免疫沉淀用抗_TRAF6mAb替代抗-TRAF2mAb外，如實(shí)施例13中所述處理細(xì)胞，只不過(guò)對(duì)于免疫沉淀，以抗_TRAF6mAb替代抗_TRAF2mAb?？芍噩F(xiàn)地從誘導(dǎo)的表達(dá)boMxl的細(xì)胞(克隆V103)、但未從誘導(dǎo)的表達(dá)人MxA-(克隆VA8)、豬Mxl-(克隆VSK6)、黑長(zhǎng)尾猴Mx-(野生型Vero細(xì)胞)或PEEESE缺陷牛Mxl(克隆VlOSniut)的Vero細(xì)胞系回收到與boMxl—致的具有75kDa表觀分子量的條帶，這顯示TRAF6有效地結(jié)合boMxl但不結(jié)合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。圖12顯示了Mx表達(dá)抑制高致病性甲型禽流感病毒的復(fù)制?？沽鞲谢钚栽诒磉_(dá)缺乏PEEESE的boMxl的Vero細(xì)胞中顯著降低。用H5N1甲型流感病毒原液的適當(dāng)稀釋物感染誘導(dǎo)的(黑框，多西環(huán)素lug/mL)和非誘導(dǎo)的(白框，媒介物)V103(boMxl)、V103mut(boMxlmut)和VA8(huMxA)細(xì)胞的匯合物，進(jìn)行48小時(shí)。將培養(yǎng)物上清液的病毒滴度作圖，如利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法按一式三份對(duì)雞成纖維細(xì)胞所測(cè)定的。TCID5050%的組織培養(yǎng)感染劑量；0，I和I(下方)感染復(fù)數(shù)。標(biāo)繪值為2_3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土SD。圖13顯示了牛Mxl蛋白(SEQIDNO14)與人MxA蛋白(SEQIDNO15)的序列比對(duì)。該比對(duì)顯示在626個(gè)氨基酸殘基重疊中存在77%的同一性。比對(duì)清楚地顯示牛Mxl蛋白中的基序PEEESE相應(yīng)于人MxA蛋白中的PEDENE。符號(hào)“+”表示嵌合Mx構(gòu)建體i)人N-末端/牛GED(huN/GEDbo)和ii)牛N-末端/人GED(boN/GEDhu)的C末端GED部分的第一個(gè)氨基酸殘基。圖14顯示了牛Mxl蛋白(SEQIDNO14)與野豬(Susscrofa)Mxl蛋白(SEQIDNO16)的序列比對(duì)。該比對(duì)顯示在635個(gè)氨基酸殘基重疊中存在81.4%的同一性。該比對(duì)清楚地顯示牛Mxl蛋白中的基序PEEESE相應(yīng)于豬Mxl蛋白中的PEDESG。圖15顯示了人MxA蛋白的經(jīng)修飾的序列，其中基序PEDENE被牛TRAF2/TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域PEEESE替代；新序列被命名為SEQIDNO:17。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能和活性已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在體外，與其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白相比較，牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白顯示最強(qiáng)的曾經(jīng)鑒定的抗甲型流感病毒活性。此外，在體內(nèi)確認(rèn)了由該特定Mx發(fā)動(dòng)蛋白產(chǎn)生的特別強(qiáng)的抗甲型流感病毒活性，從而提供了用于預(yù)防或治療甲型流感病毒相關(guān)疾病的最可靠的分子。如從現(xiàn)有技術(shù)所預(yù)期的，假定該前所未有的抗病毒活性由蛋白質(zhì)的C末端區(qū)段(所謂的GED)支持。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)用被賦予弱抗甲型流感病毒活性的任何Mx發(fā)動(dòng)蛋白的GED替代牛Mxl中的GED導(dǎo)致仍被賦予上述罕見抗病毒活性的嵌合Mx發(fā)動(dòng)蛋白。相反地，將牛GED移植在弱抗流感Mx發(fā)動(dòng)蛋白的骨架上導(dǎo)致仍然弱的抗流感嵌合Mx發(fā)動(dòng)蛋白。因此本發(fā)明提供了未被插入C末端GED區(qū)段的Mx抗病毒活性增強(qiáng)子，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員不能預(yù)測(cè)的。本發(fā)明人鑒定了牛、綿羊和印度水牛Mxl骨架中的新型TRAF2和TRAF6結(jié)合基序，所述結(jié)合基序不存在于迄今測(cè)試的所有脊椎動(dòng)物Mx發(fā)動(dòng)蛋白中。還發(fā)現(xiàn)具有該新型TRAF2/TRAF6結(jié)合基序的Mx發(fā)動(dòng)蛋白有效地結(jié)合TRAF2和TRAF6，而缺乏該新型TRAF2/TRAF6結(jié)合基序的Mx發(fā)動(dòng)蛋白不結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)該新型TRAF2/TRAF6結(jié)合基序在Mx骨架中的存在足以驅(qū)動(dòng)上述前所未有的抗甲型流感活性。支持這些發(fā)現(xiàn)的是，TRAF2/TRAF6結(jié)合基序缺陷突變型牛Mxl顯示極弱的抗甲型流感病毒活性。因此，本發(fā)明顯示TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或TRAF6結(jié)合基序在Mx發(fā)動(dòng)蛋白中的插入足以增強(qiáng)其抗甲型流感活性。本發(fā)明利用包含功能性TRAF2和/或TRAF6結(jié)合基序的野生型和突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白，所述發(fā)動(dòng)蛋白顯示優(yōu)于由缺乏本文公開的活性增強(qiáng)子的相應(yīng)Mx發(fā)動(dòng)蛋白骨架顯示的抗甲型流感活性的抗甲型流感活性。許多方法可被本領(lǐng)域技術(shù)人員用來(lái)搜索本文公開的Mx發(fā)動(dòng)蛋白增強(qiáng)子。例如，兩個(gè)代表性方法是肽文庫(kù)的篩選或從被賦予TRAF2和/或TRAF6結(jié)合能力的任何已知或仍然未鑒定的蛋白質(zhì)合成重疊肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，Mx發(fā)動(dòng)蛋白活性增強(qiáng)子包含由SEQIDNO69組成的完全或部分序列。本發(fā)明還利用包含TRAF2和/或TRAF6結(jié)合基序的野生型和突變型Mx發(fā)動(dòng)蛋白，所述發(fā)動(dòng)蛋白顯示優(yōu)于由缺乏本文公開的活性增強(qiáng)子的相應(yīng)Mx發(fā)動(dòng)蛋白骨架顯示的抗病毒活性的任何抗病毒活性。本文中公開的Mx抗病毒活性增強(qiáng)子可包含來(lái)源于腫瘤壞死因子受體I型和2型(TNFR1和TNFR2)、CD27、CD30、CD40、0x40、LTPR、另一種TRAF相關(guān)受體(ATAR)、4_1BB、NF-KB-誘導(dǎo)激酶(NIK)、潛伏膜蛋白(latentmembraneprotein)-I(LMPl)和來(lái)源于牛、綿羊或印度水牛的Mxl的TRAF2結(jié)合基序。本文中公開的Mx抗病毒活性增強(qiáng)子還可包含來(lái)源于牛Mxl、綿羊Mxl、印度水牛Mx1、CD40、NF-k-B的受體激活物(RANK)、IL_1受體相關(guān)激酶I(IRAKI)、IL-I受體相關(guān)激酶2(IRAK2)、IRAKM、受體相互作用蛋白-2(RIP2)、MALT1、MyD88適體樣蛋白(MAL)、含Toll/IL-IR結(jié)構(gòu)域適體誘導(dǎo)IFN-β(TRIF)、人HSVl和HSV2皰疹病毒、獼猴HSVl皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒或人卡波氏皰疹病毒的TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自SEQIDNo.26-77的完全或部分序列。其中可天然或人工插入本文中公開的抗病毒活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白可來(lái)源于許多不同的物種。代表性發(fā)動(dòng)蛋白包括人ΜχΑ、人MxB、小鼠MxI、小鼠Μχ2、大鼠MxI、Μχ2和Μχ3、豚鼠Μχ、豬Mxl和Μχ2、馬Mxl和Μχ2、雞Μχ、火雞MxJlΜχ、虹鱒魚Μχ、鮭魚Mx等。·本發(fā)明還提供了使用本文中公開的Mx抗病毒活性增強(qiáng)子抑制甲型流感病毒的復(fù)制的方法。因此使用包含本文中公開的活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白導(dǎo)致降低的致死率、減輕的疾病嚴(yán)重度、降低的細(xì)胞因子產(chǎn)量、減少的次級(jí)感染率和減少的病毒排出(在人或動(dòng)物被甲型流感病毒感染的情況下)。使用包含本文中公開的活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白因而還可導(dǎo)致減少的甲型流感病毒的遺傳偏差或減少的甲型流感病毒株之間的遺傳再分布(geneticreassortment)。因此,使用包含本文中公開的活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白還可導(dǎo)致減少的甲型流感病毒感染的傳播性以及減小的交叉物種污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還提供了使用本文中公開的抗病毒活性增強(qiáng)子產(chǎn)生免疫學(xué)上可接受的(非變應(yīng)原的)和市場(chǎng)可接受的(消費(fèi)者友好的)能夠抗甲型流感病毒相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)基因食用動(dòng)物的方法。本發(fā)明還提供了使用本文中公開的抗病毒活性增強(qiáng)子產(chǎn)生免疫學(xué)上可接受的(非變應(yīng)原的)和市場(chǎng)可接受的轉(zhuǎn)基因食用動(dòng)物，其中甲型流感病毒對(duì)其它動(dòng)物或?qū)θ说膫鞑バ燥@著減弱。短語(yǔ)“免疫學(xué)上可接受的”是指存在于數(shù)千年來(lái)被人類食用的肉和其它動(dòng)物產(chǎn)品中，從而眾所周知不存在對(duì)人的變應(yīng)原性或類似的不期望的潛能的抗原性分子實(shí)體。短語(yǔ)“市場(chǎng)可接受的”和“消費(fèi)者友好的”是指存在于肉和其它動(dòng)物產(chǎn)品中的外源分子實(shí)體，所述外源分子實(shí)體不太引起消費(fèi)者的反對(duì)，因?yàn)檫@些分子實(shí)體一直以來(lái)被人食用。本發(fā)明還提供了抑制甲型流感病毒相關(guān)癥狀、損傷和功能障礙的方法，包括給個(gè)體施用本發(fā)明的組合物或編碼本發(fā)明的組合物的任何多核苷酸的步驟。籍以將組合物遞送至所述個(gè)體的代表性方法包括脂質(zhì)體、病毒或任何基因遞送載體。本發(fā)明還提供了鑒定新型抗甲型流感病毒分子的方法，包括通過(guò)本發(fā)明的組合物或編碼本發(fā)明的組合物的任何多核苷酸的遺傳插入產(chǎn)生能夠抗甲型流感病毒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的步驟。本發(fā)明還提供了鑒定能夠抑制甲型流感病毒的肽或非肽分子的方法，包括步驟制備包含TRAF2和/或TRAF6結(jié)合基序的Mx發(fā)動(dòng)蛋白或多肽，在肽或非肽分子存在或不存在的情況下檢查TRAF2或TRAF6對(duì)所述Mx發(fā)動(dòng)蛋白或多肽的結(jié)合，其中在所述肽或非肽分子存在的情況下減少的結(jié)合表明所述肽或非肽分子能夠抑制甲型流感病毒。優(yōu)選地，TRAF6結(jié)合基序來(lái)源于選自牛Mxl、綿羊Mxl、印度水牛Mxl、CD40、RANK、IRAKI、IRAK2、IRAKM、RIP2、hMALTl、MAL,TRIF、hHSVlUL-37、hHSV2UL_37、獼猴HSV1UL-37、hCMVUL-37和人卡波氏皰疹病毒0RF-63的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)源于選自TNFR1、TNFR2、⑶27、CD30、CD40、0x40、LTbR、ATAR、4-lBB、NIK、LMPl，以及來(lái)源于牛、綿羊或印度水牛Mxl的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自SEQIDNo.26-77的序列。本發(fā)明還提供了包含藥物載體和含有本文中公開的活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白的可接受的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物包含其中活性增強(qiáng)子具有選自SEQIDNo.26-77的序列的Mx發(fā)動(dòng)蛋白或其片段。短語(yǔ)“可接受的藥物組合物”是指當(dāng)給受試者施用時(shí)不產(chǎn)生過(guò)敏或類似的不期望的反應(yīng)的分子實(shí)體和成分。本發(fā)明還提供了包含基因治療載體和編碼包含本文中公開的活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白的多核苷酸的可接受的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物編碼其中活性增強(qiáng)子具有選自SEQIDNo.26-77的序列的Mx發(fā)動(dòng)蛋白或其片段。短語(yǔ)“可接受的藥物組合物”是指當(dāng)給受試者施用時(shí)不產(chǎn)生過(guò)敏或類似的不期望的反應(yīng)的分子實(shí)體和成分。本發(fā)明還涉及本文中公開的肽活性增強(qiáng)子或包含本文中公開的活性增強(qiáng)子的Mx發(fā)動(dòng)蛋白的肽、多肽、蛋白質(zhì)或非肽和非蛋白質(zhì)類似物，其模擬所述肽增強(qiáng)子和Mx發(fā)動(dòng)蛋白的增強(qiáng)的抗流感功能。這些類似物可用作建立TRAF2和/或TRAF6-介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)在病毒性疾病的體外和體內(nèi)模型中的作用的強(qiáng)有力工具，以及本身用作預(yù)防劑和/或治療劑。本發(fā)明還涉及使用肽、多肽、蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子抑制甲型流感病毒的方法，其中所述分子對(duì)甲型流感病毒的抑制遵從于TRAF2和/或TRAF6與所述分子之間的分子相互作用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可以例如合成，從純化的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)制備，或使用本領(lǐng)域已知的重組方法和技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的肽。雖然本文中描述了用于其制備的具體技術(shù)，但應(yīng)當(dāng)理解所有適用于產(chǎn)生此類肽的適當(dāng)技術(shù)意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，此類技術(shù)包括DNA和蛋白質(zhì)測(cè)序、克隆、表達(dá)以及允許編碼和表達(dá)本發(fā)明的每一種肽的原核和真核載體的構(gòu)建的其它重組工程技術(shù)?？砂凑誃iotechnologyandAppliedBiochem.,12:436(1990)中描述的方法通過(guò)妝合成或通過(guò)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Eds.Ausubel,F.M.,等人，JohnWiley&Sons,N.Y.(1987)中描述的方法制備蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)表達(dá)編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸或通過(guò)從由核酸編碼的較長(zhǎng)長(zhǎng)度的多肽切割來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)?？衫帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)在細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物宿主中進(jìn)行編碼的多肽的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)如下方式獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)將DNA序列克隆入載體，所述載體始于在期望的蛋白質(zhì)序列的第一個(gè)DNA密碼子的5’上游插入的甲硫氨酸的DNA密碼子，以及利用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)將相應(yīng)于期望的蛋白質(zhì)的最后一個(gè)氨基酸的DNA密碼子修飾為終止密碼子。用經(jīng)修飾的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以使編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)。誘變技術(shù)的實(shí)例包括例如PromegaProtocolsandApplicationsGffde,PromegaCorp,Madison,WI,p.98(1891)中描述的或根據(jù)CurrentProtocolsinMolecularBiology(同上)的方法。如果要通過(guò)原核載體合成蛋白質(zhì)，則編碼蛋白質(zhì)的DNA序列優(yōu)選不包含信號(hào)肽序列。此外，通常在編碼序列的第一個(gè)DNA密碼子的5’上游插入甲硫氨酸(Met)的DNA密碼子。用于將DNA克隆入載體和用于插入、缺失和修飾多核苷酸以及用于定點(diǎn)誘變的方法描述于例如PromegaProtocolsandApplicationsGuide(同上)中。可通過(guò)已知的技術(shù)、包括熱激、電穿孔、磷酸鈣沉淀和脂轉(zhuǎn)染等用具有與其連接的期望的DNA序列的載體、優(yōu)選表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞或細(xì)菌。隨后可提取蛋白質(zhì)，利用例如高壓液相色譜(HPLC)、離子交換層析或凝膠滲透層析進(jìn)行純化。然而，本領(lǐng)域已知的獲得本發(fā)明的肽所必需的不同步驟或這些步驟的組合或等同步驟的其它方法和技術(shù)預(yù)期也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。下列術(shù)語(yǔ)用于描述兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系"參照序列"、〃比較窗口(comparisonwindow)"、〃序列同一性〃、〃序列同一性的百分比〃和〃實(shí)質(zhì)同一性"。"參照序列"為用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列；參照序列可以是較大序列的子集，例如作為序列表中給定的全長(zhǎng)cDNA或基因序列的區(qū)段，或可包含完整cDNA或基因序列。用于對(duì)齊比較窗口的序列的最佳比對(duì)可以例如利用Smith和WatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，利用Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對(duì)算法，利用Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)的相似性搜索法或利用這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)來(lái)進(jìn)行。當(dāng)用于多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)〃實(shí)質(zhì)同一性〃或〃實(shí)質(zhì)序列同一性〃意指兩個(gè)多肽序列，當(dāng)例如利用程序GAP或BESTFIT，使用缺省缺口權(quán)重(gapweights)最佳對(duì)齊時(shí)，共有至少80%的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性或更大的序列一性?！ò俜直劝被嵬恍浴ɑ?百分比氨基酸序列同一性"是指當(dāng)最佳地對(duì)齊時(shí)大約具有指定的相同氨基酸的百分比的兩個(gè)多肽的氨基酸的比較。例如，"95%的氨基酸同一性〃是指當(dāng)最佳地對(duì)齊時(shí)具有95%的氨基酸同一性的兩個(gè)多肽的氨基酸的比較。優(yōu)選地，不相同的殘基位置相異在于保守氨基酸置換。例如，具有相似化學(xué)性質(zhì)例如電荷或極性的氨基酸的置換可能不影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。實(shí)例包括谷氨酰胺對(duì)于天冬酰胺或谷氨酸對(duì)于天冬氨酸。短語(yǔ)"實(shí)質(zhì)上純化的"或"分離的〃，當(dāng)指肽或蛋白質(zhì)時(shí)，意指基本上不含其它細(xì)胞組分的化學(xué)成分。其優(yōu)選以均一狀態(tài)存在，雖然其可以以干燥形式存在或存在于含水溶液中。通常使用分析化學(xué)技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜測(cè)定純度和均一性。作為存在于制劑中的優(yōu)勢(shì)種類的蛋白質(zhì)是實(shí)質(zhì)上純的。通常，實(shí)質(zhì)上純的或分離的蛋白質(zhì)包含超過(guò)80%的存在于制劑中的所有大分子種類。優(yōu)選地，純化蛋白質(zhì)以代表大于90%的存在的所有大分子種類。更優(yōu)選將蛋白質(zhì)純化至大于95%，最優(yōu)選將蛋白質(zhì)純化至基本上同質(zhì)，其中利用常規(guī)技術(shù)不能檢測(cè)到其它大分子種類。本發(fā)明的核酸本文中還提供了包含編碼本發(fā)明的肽的DNA或RNA序列(多核苷酸)的分離的核酸。本發(fā)明的核酸還可包含用于表達(dá)本發(fā)明的肽的載體。在一些實(shí)施方案中，DNA可包括編碼Mx蛋白的cDNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性,可在核苷酸序列中產(chǎn)生不導(dǎo)致編碼的氨基酸序列的改變的置換。因此本文中定義的"實(shí)質(zhì)上同一的"序列包括本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還理解，本文中描述的任何DNA分的兩條互補(bǔ)鏈包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)〃實(shí)質(zhì)同一性〃或〃實(shí)質(zhì)序列同一性"，當(dāng)用于核酸序列時(shí)和如本文中所用，是指多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含這樣的序列，所述序列在至少20個(gè)核苷酸位置的比較窗口上，常見地在至少25-50個(gè)核苷酸位置的比較窗口上與參照序列相比較具有至少85%的序列同一性，優(yōu)選至少90-95%的序列同一性，更優(yōu)選至少99%的序列同一性，其中序列同一性的百分比通過(guò)在比較窗口上將參照序列與可包括總共20%或更少的參照序列的缺失或添加的多核苷酸序列相比較來(lái)進(jìn)行計(jì)算。參照序列可以是較大序列的子集。治療方案用于治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的方法包括給患者施用甲型流感病毒抑制量的本發(fā)明的Mx蛋白。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"治療"意指甲型流感病毒引發(fā)的疾病的癥狀的預(yù)防、緩和或嚴(yán)重度的減輕。類似地，本發(fā)明的Mx蛋白的甲型流感病毒抑制有效劑量為足以預(yù)防、緩和或減輕流感癥狀的嚴(yán)重度的劑量。可以單獨(dú)地或與彼此組合地或與其它病毒特別地甲型流感病毒抑制劑組合地施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)。通常，以約8微克至3，000μg/kg/天，更優(yōu)選約20至1，500μg/kg/天的量，優(yōu)選每天施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)一次或兩次。然而，也可施用其它量，包括顯著更低或更高的量。通過(guò)肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)、通過(guò)任何其它可接受的施用途徑給需要治療的人受試者施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)?；虔煼ɡ弥亟MDNA技術(shù)將編碼包含根據(jù)本發(fā)明的TRAF2/6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Mx蛋白或肽的核酸(多核苷酸)遞送入患者細(xì)胞或在體內(nèi)給患者提供基因產(chǎn)物的載體的基因療法也被考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。基因治療技術(shù)具有通過(guò)將治療性基因的表達(dá)靶向目標(biāo)組織例如骨骼肌、心肌、血管內(nèi)皮或平滑肌或?qū)嶓w瘤或循環(huán)腫瘤細(xì)胞來(lái)限制受試者與基因產(chǎn)物例如多肽的接觸的潛能。例如，PCT專利申請(qǐng)公布號(hào)W093/15609公開了通過(guò)使用導(dǎo)管系統(tǒng)將干擾素基因施用至血管壁損傷的區(qū)域進(jìn)行的干擾素基因至血管組織的遞送。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將編碼能夠酶促轉(zhuǎn)化前體藥物的蛋白質(zhì)的腺病毒載體、“自殺基因”和編碼細(xì)胞因子的基因直接施用至實(shí)體瘤中。將治療性基因靶向目標(biāo)組織的其它方法包括三個(gè)一般類型轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向(transductionaltargeting)、位置革巴向(positionaltargeting)和轉(zhuǎn)錄革巴向(transcriptionaltargeting)(關(guān)于綜述，參見，例如，Miller等人FASEBJ.9:190-199(1995))。轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向是指選擇性進(jìn)入特定細(xì)胞，主要通過(guò)選擇受體配體來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蚪M內(nèi)的位置靶向是指至期望的基因座(例如染色質(zhì)的活性區(qū)域)中的整合，或通過(guò)與內(nèi)源核苷酸序列例如靶基因同源重組。轉(zhuǎn)錄靶向是指通過(guò)整合具有針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞定制的基因表達(dá)的高度特異性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子獲得的選擇性表達(dá)。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括肝特異性啟動(dòng)子(Zou等人，Endocrinology138:1771-1774(1997))；小腸特異性啟動(dòng)子(Oliveira等人，J.Biol.Chem.271:31831-31838(1996));肌酸激酶的啟動(dòng)子，其已被用于在肌肉和心臟組織中指導(dǎo)肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的cDNA表達(dá)(Cox等人，Nature364:725-729(1993));和用于在B細(xì)胞中表達(dá)自殺基因的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的啟動(dòng)子(Maxwell等人，CancerRes.51:4299-4304(1991))ο還已表征了內(nèi)皮細(xì)胞特異性調(diào)控區(qū)(Jahroudi等人，Mol.Cell1Biol.14:999-1008(1994))。兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被構(gòu)建，其攜帶處于白蛋白或α-甲胎蛋白啟動(dòng)子的控制之下的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Huber等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8039-8043(1991))以分別靶向肝譜系的靶細(xì)胞和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞。此類組織特異性啟動(dòng)子可用于逆轉(zhuǎn)錄毒載體(Hartzoglou等人，J.Biol.Chem.265:17285-17293(1990))和腺病毒載體(Friedman等A,Mol.Cell.Biol.6:3791-3797(1986))并且仍然保持它們的組織特異性。有助于在目標(biāo)組織中的表達(dá)特異性的其它元件可包括分泌前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、核定位信號(hào)、內(nèi)吞體裂解肽等。優(yōu)選地，這類元件來(lái)源于目標(biāo)組織以有助于特異性。用于實(shí)施本發(fā)明的病毒載體系統(tǒng)包括但不限于腺病毒、皰疫病毒、腺相關(guān)病毒、鼠·微小病毒(MVM)、HIV、辛德比斯病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒例如勞斯肉瘤病毒和MoMLV。通常，將編碼目標(biāo)治療性多肽或肽的核酸插入這類載體以使得能夠包裝核酸，通常通過(guò)伴隨病毒DNA、敏感性宿主細(xì)胞的感染和目標(biāo)多肽的表達(dá)。類似地，可通過(guò)添加允許受體介導(dǎo)的至特定細(xì)胞內(nèi)的胞吞的受體的受體配體或抗體來(lái)修飾用于包裝本發(fā)明的重組構(gòu)建體的病毒包膜(例如，WO93/20221、WO93/14188；W094/06923)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體連接于病毒蛋白質(zhì)例如腺病毒顆粒，以促進(jìn)胞吞作用(Curiel等人，Proc.Natl.Acad.Scl.U.S.A.88:8850-8854(1991))。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的分子綴合物可包括微管抑制劑(WO94/06922);模擬流感病毒血凝素的合成肽(Plank等人，J.Biol.Chem.269:12918-12924(1994));和核定位信號(hào)，例如SV40T抗原(WO93/19768)?？衫枚喾N方法在體內(nèi)或離體地將核酸引入目標(biāo)組織。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)這樣的方法如顯微注射、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體融合或微粒轟擊(biolistics)將核酸引入細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，核酸被目標(biāo)組織直接吸收。在其它實(shí)施方案中，將核酸包裝在病毒載體系統(tǒng)中以幫助向細(xì)胞內(nèi)的引入。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物離體地施用至從患者外植的細(xì)胞或組織，隨后將其返回患者?；蛑委煒?gòu)建體的離體施用的實(shí)例包括Axteaga等人，CancerResearch56(5):1098-1103(1996)；Nolta等人，ProcNad.Acad.Sci.USA93(6):2414-9(1996)；Koc等人,SeminarsinOncology23(1):46-65(1996)；Raper等人，AnnalsofSurgery223(2):116-26(1996)；Dalesandro等人，JThorac.Cardi.Surg.11(2):416-22(1996)；和Makarov等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA93(1):402-6(1996)。施用方法被引入宿主或宿主細(xì)胞的載體的形式可改變，這部分取決于載體被體外引入還是被體內(nèi)引入。例如，核酸可以是閉環(huán)的、具有缺口的或線性化的，這取決于載體將被以基因組外形式(extragenomically)維持(即，作為自主復(fù)制載體)、以原病毒或原曬菌體的形式被包含、被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、瞬時(shí)感染(與復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒的使用一樣)還是通過(guò)雙交換或單交換重組事件被穩(wěn)定地引入宿主基因組。在引入宿主之前，可將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體配制成用于治療性和預(yù)防性治療方法的各種組合物。具體地，可通過(guò)與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合將載體制備為藥物組合物，或可將其配制來(lái)適用于人或獸用應(yīng)用。因此，藥物組合物可包含上述載體的一種或多種，優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的載體組合。藥學(xué)上可接受的載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，適當(dāng)?shù)氖┯梅椒▽?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是公知的。載體的選擇可部分地由具體的載體以及由用于施用組合物的具體方法來(lái)決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，不同的施用組合物的途徑是可獲得的，并且，雖然可使用超過(guò)一個(gè)途徑來(lái)進(jìn)行施用，但特定的途徑可提供比另一種途徑更直接和更有效的反應(yīng)。因此，存在許多種適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明的組合物的制劑?？蓪⒂砂景l(fā)明的多核苷酸的載體單獨(dú)或與其它抗病毒化合物組合組成的組合物配制為適用于胃腸外施用、優(yōu)選腹膜內(nèi)施用的制劑。這樣的制劑可包括含水和無(wú)水等滲無(wú)菌注射液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使制劑與預(yù)定接受者的血液等滲的溶質(zhì)，和含水和無(wú)水無(wú)菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。可以以單位劑量或多劑量密封的容器例如安瓿和小瓶提供制劑，還可將制劑在冷凍干燥(凍干)條件下貯存，只需在即將使用之前添加無(wú)菌液體載體例如水以用于注射?？蓮臒o(wú)菌粉齊U、粒劑和片劑制備即時(shí)注射液(Extemporaneouslyinjectablesolution)和懸浮液,如本文中所描述的。還可制備適用于通過(guò)吸入施用的氣溶膠制劑。可將氣溶膠制劑置于加壓的可接受推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾戎?。在本發(fā)明的說(shuō)明書中，給動(dòng)物特別是人施用的劑量應(yīng)當(dāng)足以在合理的時(shí)間范圍內(nèi)誘導(dǎo)被感染的個(gè)體的治療反應(yīng)。劑量將可通過(guò)用于治療的具體載體的效能、疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度以及被感染的個(gè)體的體重和年齡來(lái)確定。劑量的大小也可通過(guò)可伴隨所使用的具體載體的使用的任何有害副作用的程度來(lái)確定?？偸瞧谕褂泻Ω弊饔帽M可能降至最低。劑量可以以單位劑量形式(例如片劑或膠囊)存在。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"單位劑量形式"是指適合用作用于人和動(dòng)物受試者的單元化劑量的物理上分開的單位，每一個(gè)單位包含預(yù)定量的載體(單獨(dú)的或與其它抗病毒劑組合的)，其經(jīng)計(jì)算以足以與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或媒介物協(xié)作產(chǎn)生期望的作用的量存在。本發(fā)明的單位劑量形式的規(guī)范取決于在宿主中所使用的具體化合物和待達(dá)到的作用以及與每一種化合物相關(guān)的藥效學(xué)。施用的劑量應(yīng)當(dāng)是“抗病毒有效量”或在個(gè)體患者中達(dá)到“有效水平”所必需的量。由于“有效水平”用作給藥的優(yōu)選終點(diǎn)，因此取決于藥代動(dòng)力學(xué)、藥物分布和代謝的個(gè)體間差異，實(shí)際劑量和時(shí)間安排可變化。可將“有效水平”定義為例如患者中期望的血液或組織水平，該水平對(duì)應(yīng)于一種或多種包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的載體的濃度，所述濃度在預(yù)測(cè)化合物的臨床抗病毒活性的測(cè)定中抑制病毒例如甲型流感病毒。當(dāng)將本發(fā)明的組合物與已知的抗病毒化合物組合使用時(shí)，本發(fā)明的化合物的“有效水平”也可變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地測(cè)定待使用的組合物的確切制劑的適當(dāng)劑量、時(shí)間安排和施用方法，以在個(gè)體患者中達(dá)到期望的“有效水平”。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可通過(guò)直接(例如，分析化學(xué)分析法)或間接(例如，利用病毒感染的替代指示劑)分析適當(dāng)?shù)幕颊邩悠?例如，血液和/或組織)或使用報(bào)道蛋白來(lái)容易地確定和使用本發(fā)明的化合物的“有效水平”的適當(dāng)指示劑。藥物組合物，當(dāng)用于治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病時(shí)，可包含與根據(jù)本發(fā)明的載體結(jié)合的其它藥物。這類其它藥物可以以它們的常規(guī)方式進(jìn)行使用。具體地，考慮到使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑。除了先前描述的藥物外可使用的這些其它藥物的其它代表性實(shí)例包括抗病毒化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫刺激劑、抗生素和可用于治療流感病毒的其它試劑和治療方案(包括被認(rèn)為替代性藥物的藥物)。免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激劑包括但不限于各種白細(xì)胞介素、CD4，細(xì)胞因子，抗體制劑、血液傳輸和細(xì)胞傳輸?？股匕ǖ幌抻诳拐婢鷦?、抗細(xì)菌劑。制劑和藥物組合物可配制本發(fā)明的組合物以通過(guò)本領(lǐng)域已知的可接受用于給哺乳動(dòng)物受試者優(yōu)選人施用的方式進(jìn)行施用。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過(guò)注射將本發(fā)明的組合物直接施用至組織中或施用至供應(yīng)目標(biāo)組織的血管中。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可“局域地(locoregionally)”，即，膀胱內(nèi)、傷口內(nèi)和/或表面地施用本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通過(guò)注射、吸入、栓劑、透皮遞送等全身性施用本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通過(guò)導(dǎo)管或其它裝置施用組合物以使得能夠到達(dá)遠(yuǎn)距離的目標(biāo)組織，例如內(nèi)臟器官。還可在在倉(cāng)儲(chǔ)類型裝置(depottypedevice)、植入物或封裝膠囊的制劑中施用本發(fā)明的組合物以使組合物緩慢或持續(xù)釋放。為了施用基于或來(lái)源于本發(fā)明的治療劑，應(yīng)理解可將適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑和其它試劑整合入制劑以提供改進(jìn)的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等。多種適當(dāng)?shù)闹苿┛梢娪谒兴幬锘瘜W(xué)家已知的處方集Remington’sPharmaceuticalSciences,(第15版，MackPublishingCompany,Easton,Pennsylvania(1975))，特別地其中由Blaug，Seymour編著的第87章。此類制劑包括例如粉劑、糊劑、軟膏、凍膠、蠟、油、液體、無(wú)水吸收性基質(zhì)、水包油或油包水乳劑、乳狀碳蠟(多種分子量的聚乙二醇)、包含碳蠟的半固體凝膠和半固體混合物。前述制劑的任一種可適用于根據(jù)本發(fā)明的治療和療法，只要制劑中的活性劑未被制劑滅活并且制劑是生理上相容的。有效治療所必需的活性成分的量將取決于許多不同的因素，包括施用方法、靶位置、患者的生理狀態(tài)以及施用的其它藥劑。因此，應(yīng)當(dāng)?shù)味ㄖ委焺┝恳宰顑?yōu)化安全性和效力。通常，體外使用的劑量可在用于活性成分的原位施用的量上提供有用的指導(dǎo)。用于治療特定病癥的有效劑量的動(dòng)物測(cè)試將提供人劑量的其它預(yù)測(cè)指征。在例如GoodmanandGilman'sthePharmacologicalBasisofTherapeutics,第7版(1985),MacMillanPublishingCompany,NewYork和Remington'sPharmaceuticalSciences第18版，(1990)MackPublishingCo,EastonPenn中描述了各種考慮。本文中論述了施用方法，包括口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮膚、經(jīng)鼻、離子電滲施用(iontophoreticadministration)等。取決于施用方法，可以以多種單位劑量形式施用本發(fā)明的組合物。例如，適用于口服施用的單位劑量形式包括固體劑型例如粉劑、片劑、丸劑、膠囊和錠劑，和液體劑型例如酏劑、糖漿劑和懸浮劑。還可以以無(wú)菌液體劑型胃腸外施用活性成分。明膠膠囊包含活性成分和惰性成分粉末載體例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等?？杀惶砑右蕴峁┢谕念伾?、味道、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散或其它已知的期望特征的其它惰性成分的實(shí)例為紅氧化鐵、硅膠、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦、食用白墨水(whiteink)等。類似的稀釋劑可用于制備壓制片劑?？蓪⑵瑒┖湍z囊劑制造為持續(xù)釋放產(chǎn)品以在數(shù)小時(shí)的時(shí)段中提供藥物的持續(xù)釋放。壓制片劑可以被糖包被或膜覆蓋以掩蓋任何令人厭惡的味道并保護(hù)片劑免受大氣損害，或被腸溶衣包被以在胃腸道中進(jìn)行選擇性崩解。用于口服施用的液體劑型可包含著色劑和調(diào)味劑以增加患者的接受度。本發(fā)明的組合物在藥物制劑中的濃度可根據(jù)所選擇的具體施用模式而廣泛地變化，即從按重量計(jì)算低于約O.1%，通常2%或至少約2%至多達(dá)20%至50%或更多，并且將主要通過(guò)液體體積、粘度等來(lái)進(jìn)行選擇。本發(fā)明的組合物還可通過(guò)脂質(zhì)體來(lái)施用。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、薄片層等。在此類制劑中，將待遞送的本發(fā)明的組合物單獨(dú)地或與結(jié)合期望的靶的分子例如抗體或與其它治療性或免疫原性組合物組合作為脂質(zhì)體的部分摻入。因此，可全身性遞送充滿或布置有本發(fā)明的期望的組合物的脂質(zhì)體，或可將其導(dǎo)向目標(biāo)組織，在所述組織中脂質(zhì)體隨后遞送選擇的治療性/免疫原性肽組合物。從標(biāo)準(zhǔn)的囊泡形成脂質(zhì)(其通常包含中性和帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的脂質(zhì)體。通常通過(guò)考慮例如脂質(zhì)體尺寸、酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血流中的穩(wěn)定性來(lái)指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。各種脂質(zhì)描述于例如Szoka等人Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，美國(guó)專利No.4，235，871,4,501，728,4,837，028和5，019，369(通過(guò)引用并入本文)中?？梢砸愿鶕?jù)，除其它以外，施用方式、待遞送的本發(fā)明的組合物和待治療的疾病的分期而變化的劑量通過(guò)靜脈內(nèi)、局域、表面等施用包含本發(fā)明的組合物的脂質(zhì)體懸浮劑。對(duì)于固體組合物，可使用常規(guī)無(wú)毒固體載體，包括例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服施用，通過(guò)摻入任何通常使用的賦形劑例如先前列出的那些載體和通常10-95%(更優(yōu)選以25%-75%的濃度)的活性成分(即一種或多種本發(fā)明的組合物)來(lái)形成藥學(xué)上可接受的無(wú)毒組合物。對(duì)于氣溶膠施用，優(yōu)選以精細(xì)磨碎的形式連同表面活性劑和推進(jìn)劑一起提供本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的組合物的常見百分比為按重量計(jì)0.01%-20%，優(yōu)選1%-10%。表面活性劑當(dāng)然必須為無(wú)毒的，優(yōu)選溶于推進(jìn)劑。此類試劑的代表為包含6至22個(gè)碳原子的脂肪酸例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、olestericacid和油酸與脂肪族多元醇或其環(huán)酐的酯或部分酯?？墒褂没旌硝ダ缁旌系幕蛱烊坏母视王ァ１砻婊钚詣┛山M成按重量計(jì)O.1%_20%，優(yōu)選O.25-5%的組合物。組合物平衡為常用的推進(jìn)劑。同樣地，需要時(shí)還可包含載體例如卵磷脂以進(jìn)行鼻內(nèi)遞送。另外可利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)于倉(cāng)儲(chǔ)類型系統(tǒng)、膠囊化形式或植入物中遞送本發(fā)明的組合物。類似地，可通過(guò)泵將組合物遞送至目標(biāo)組織。通常在癥狀發(fā)作后給患者施用本發(fā)明的組合物，雖然在一些實(shí)施方案中治療也可以是預(yù)防性。通常，通過(guò)每天一次、每周一次或每月一次直接施用多肽進(jìn)行治療，進(jìn)行足以減輕、阻止或緩解癥狀的一段時(shí)間。通常以數(shù)月的間隔進(jìn)行利用本發(fā)明的核酸的治療。在一些實(shí)施方案中，在子宮內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明的組合物的施用。還可在試劑盒中在上述包裝材料(wrapping)或容器中將本發(fā)明的組合物作為緩釋組合物(例如以海綿、皮膚貼片、皮下植入物提供的日單位、周單位、月單位)提供。在該情況下，患者可從容器釋放一個(gè)單位的組合物并且如試劑盒說(shuō)明書中所標(biāo)明的來(lái)使用它。隨后可在指定的時(shí)期結(jié)束時(shí)用新鮮單位替換組合物等等。本發(fā)明的組合物還可通過(guò)注射施用，如上文中所述。通常，可將肽單獨(dú)施用，或例如在糖尿病的情況下，將其在也包含胰島素的組合物中施用。對(duì)于組合物的緩釋形式也如此。類似地，可將本發(fā)明的肽在也包含另一種藥物的組合物中進(jìn)行施用。下列實(shí)施例被提供用來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明的不同實(shí)施方案并且無(wú)意以任何方式限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，本發(fā)明能夠產(chǎn)生上述對(duì)象和獲得上述有利方面，以及其中固有的對(duì)象和有利方面。實(shí)施例I(對(duì)照?qǐng)DI):牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白在用高致病性H7N7甲型流感病毒株感染的Vero細(xì)胞中顯示出與先前對(duì)于其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白宣稱的抗甲型流感活性相比較更強(qiáng)的抗甲型流感活性在本實(shí)施例中，由牛Mxl同種型的條件表達(dá)賦予的對(duì)甲型流感病毒復(fù)制的抗性的程度通過(guò)測(cè)量由不表達(dá)或表達(dá)所述Mxl的Vero細(xì)胞單層產(chǎn)生的48小時(shí)的甲型流感病毒產(chǎn)量來(lái)確定。編碼所述Mxl的全長(zhǎng)cDNA的產(chǎn)生一按照制造商的說(shuō)明書利用TRIzol試劑從IFNa-刺激的(I.000U/ml重組IFNaA/D，進(jìn)行24小時(shí))Madin-Darby牛腎細(xì)胞提取總RNA，使用ImPiOmII技術(shù)對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)可在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的cDNA序列設(shè)計(jì)成對(duì)的特異性寡核苷酸引物。如下進(jìn)行PCR:在94°C進(jìn)行5分鐘，隨后進(jìn)行10個(gè)循環(huán)(在94°C進(jìn)行30秒，在62°C進(jìn)行30秒(每循環(huán)遞增+0.1°C)，在68°C進(jìn)行120秒)，隨后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(94°C進(jìn)行30秒，64°C進(jìn)行30秒，68°C進(jìn)行140秒(每循環(huán)遞增3秒))，最后在68°C進(jìn)行10分鐘。編碼所述Mxl的表達(dá)載體的構(gòu)建一利用pCRII-TOPO載體TA-連接PCR產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)Topl0。始于M13正向和反向引物，利用雙脫氧鏈終止法(利用BigDye標(biāo)記的)對(duì)幾個(gè)克隆的cDNA的兩條鏈進(jìn)行測(cè)序。將終止產(chǎn)物溶解，使用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀檢測(cè)。將來(lái)自pCRII-TOPO的Hindlll/EcoRV片段(包含選擇的Mxl同種型和正確推導(dǎo)的氨基酸序列的總跨度)在載體多克隆位點(diǎn)(MCS)的EcoRV位點(diǎn)定向亞克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA4/T0，以產(chǎn)生最終構(gòu)建體。在對(duì)片段的懸突進(jìn)行Klenow填充以使其成為平端后，可以進(jìn)行pcDNA4MCS的EcoRV位點(diǎn)與片段的HindIII位點(diǎn)的連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplO，通過(guò)氨芐青霉素抗性進(jìn)行選擇，利用限制性圖譜法進(jìn)行鑒定，通過(guò)序列分析進(jìn)行確認(rèn)。這些pcDNA4-Mxl載體將MxcDNA置于完全人巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列(包含來(lái)自細(xì)菌四環(huán)素抗性操縱子的元件)的直接轉(zhuǎn)錄控制之下，以有效地抑制/去抑制轉(zhuǎn)錄。進(jìn)行相似的方法以構(gòu)建eGFP的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因Vero細(xì)胞克隆的產(chǎn)生一產(chǎn)生的所有Vero細(xì)胞克隆來(lái)源于從ATCC(Vero/CCL-81)購(gòu)買的原始細(xì)胞(primordialcell)，并且將其在補(bǔ)充有10%胎牛血清(DMEM-10)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基中于37°C、具有5%C02-95%的空氣濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行生長(zhǎng)。使用T-Rex技術(shù)，目的在于產(chǎn)生雙轉(zhuǎn)基因VeiO克隆系，從而允許在多西環(huán)素處理后進(jìn)行所述Mxl蛋白的受到嚴(yán)密調(diào)控的條件表達(dá)。首先按照制造商的說(shuō)明書，通過(guò)Lipofectamine2000法,利用表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6-TetR(Invitrogen)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。在2周的選擇后回收殺稻瘟素抗性(lOyg/ml)轉(zhuǎn)染子，通過(guò)有限稀釋克隆所述轉(zhuǎn)染子一次。在另一輪持續(xù)4周的殺稻瘟素選擇后獲得所得的克隆，利用流式細(xì)胞術(shù)，在用pcDNA4-eGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后通過(guò)檢查eGFP的表達(dá)來(lái)篩選它們控制嚴(yán)密條件表達(dá)的能力。在利用多西環(huán)素(lyg/ml)的情況下，少數(shù)克隆兼有強(qiáng)熒光，在多西環(huán)素不存在的情況下熒光完全消失。隨后利用pcDNA4-Mxl對(duì)這些克隆之一的細(xì)胞(Vero/TetRl)進(jìn)行電穿孔。簡(jiǎn)而言之，在300μIMEM-O中制備包含2.IO6個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero/TetRl細(xì)胞和I.5μg利用ScaI線性化的pcDNA4_Mxl的等分試樣。在電穿孔(O.25kV,950μF,33ms)后，將細(xì)胞接種在不含多西環(huán)素的DMEM-IO培養(yǎng)基中，首先進(jìn)行24小時(shí)不進(jìn)行選擇,隨后用殺稻痕素(10yg/ml)和zeocin(400μg/ml)進(jìn)行選擇。在4周的選擇后回收殺稻瘟素/zeocin抗性轉(zhuǎn)染子，通過(guò)有限稀釋克隆2次。Vero細(xì)胞克隆的表型分型一通過(guò)免疫印跡法和免疫熒光法確定外源Mxl表達(dá)的存在和特征。為了進(jìn)行Western印跡分析，在4°C用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌非誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的MDBK(IFNa)和殺稻瘟素/zeocin抗性轉(zhuǎn)染子(多西環(huán)素)單層，將其刮入PBS中，通過(guò)低速離心進(jìn)行沉淀。通過(guò)在Laemmli’sSDS-樣品緩沖液中煮沸而裂解細(xì)胞沉淀，將代表10μg總細(xì)胞蛋白質(zhì)的等分試樣在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)膜上,如先前所述進(jìn)行非特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域封閉。在37°C利用于PBS/0.05%Tween-20中以1:2000稀釋的兔抗-人MXA抗血清探測(cè)封閉的膜，進(jìn)行I小時(shí)。隨后將印跡于PBS/0.05%Tween-20中進(jìn)行洗滌，將其與生物素化的山羊抗-兔IgG連接抗體在37°C—起溫育10分鐘。隨后相繼在PBS和蒸餾水中洗滌印跡，通過(guò)用辣根過(guò)氧化物酶-鏈霉抗生物素蛋白和底物3-氨基-9-乙基咔唑溫育來(lái)使印跡顯影。為了進(jìn)行免疫熒光(在蓋玻片上)和流式細(xì)胞術(shù)，用4%的PBS中的甲醛固定細(xì)胞，進(jìn)行20分鐘，將細(xì)胞在-20°C于無(wú)水甲醇中透化6分鐘。在于洗滌緩沖液(PBS中的1%的BSA)中封閉I小時(shí)后,用特異性多克隆豚鼠和兔抗-人MxA抗血清的混合物探測(cè)細(xì)胞I小時(shí)，在3個(gè)洗滌步驟后，用1:1000稀釋的綴合于Alexa488的相關(guān)二抗的混合物再溫育I小時(shí)。所有步驟均在室溫下進(jìn)行。通過(guò)表面熒光定性地或在熒光激活細(xì)胞掃描儀(fluorescence-activatedcellscanner)中定量地分析克隆。表達(dá)所述Mxl的Vero細(xì)胞的選擇一使用下列標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)免疫熒光篩選一系列約400個(gè)殺稻瘟素/zeocin抗性雙轉(zhuǎn)基因克隆的每一個(gè)中的Mxl表達(dá)模式(i)當(dāng)在不含多西環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)表達(dá)Mxl的細(xì)胞的比例，(ii)在誘導(dǎo)后表達(dá)Mxl的細(xì)胞的比例，和(iii)Mxl染色的亞細(xì)胞強(qiáng)度。在多西環(huán)素不存在的情況下，少數(shù)克隆兼有O表達(dá)，在多西環(huán)素存在的情況下，超過(guò)99%的表達(dá)，并且顯示強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)顆粒染色。使用Western印跡和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步表征這些克隆。V103克隆在誘導(dǎo)后合成75-kDa的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)被抗-人MxA抗血清識(shí)別并且與真正的牛Mxl共遷移，如從由IFNα-刺激的MDBK細(xì)胞(即從其提取相關(guān)cDNA來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的那些細(xì)胞)產(chǎn)生的條帶判斷的。在除去多西環(huán)素后，異位Mxl在隨后48小時(shí)中仍可被檢測(cè)，在除去后24小時(shí)(即，在慘入后48小時(shí))達(dá)到峰值平均熒光水平。然而在除去后72小時(shí)，已發(fā)生顯著衰減，非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的細(xì)胞開始不能被流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分了。已顯示異位Mxl表達(dá)的模式在30天的培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定，需要時(shí)，每3至5天對(duì)V103細(xì)胞進(jìn)行傳代。將來(lái)自V103細(xì)胞提取物的轉(zhuǎn)基因特異性RT-PCR的產(chǎn)物重新測(cè)序,產(chǎn)生真正的牛Mxl⑶S。本研究使用高致病性禽H7N7甲型流感病毒(A/物種/荷蘭/x/2003)。繁殖病毒，將原液在胚化期雞蛋中生長(zhǎng)，利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法測(cè)定其滴度。為了進(jìn)行感染，首先將原液的等分試樣稀釋于具有O.2%BSA的DMEM中。即時(shí)制備系列稀釋物以產(chǎn)生具有適當(dāng)感染復(fù)數(shù)的體積匹配的接種物，將其摻入誘導(dǎo)的(多西環(huán)素)或非誘導(dǎo)的(媒介物)V103細(xì)胞單層，靶感染復(fù)數(shù)為0.05、0.01、0.5和I。感染后，使接種物在37°C吸附60分鐘，然后通過(guò)用PBS充分洗滌將其除去。隨后將培養(yǎng)物在37°C于不含多西環(huán)素的DMEM/2中進(jìn)行溫育。在于37°C溫育48小時(shí)后，對(duì)培養(yǎng)物上清液進(jìn)行取樣，按一式三份利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法在雞成纖維細(xì)胞上測(cè)定病毒滴度。利用Reed-Muench法計(jì)算所有滴度。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，甲型流感病毒具有作為檢測(cè)新的Mx發(fā)動(dòng)蛋白同種型的假定的抗病毒活性的標(biāo)準(zhǔn)工具的作用。我們能夠第一次證明牛Mxl被賦予抗流感活性，如通過(guò)圖I中收集的結(jié)果判斷的，這顯示了病毒產(chǎn)量的下降和感染復(fù)數(shù)小于I的病毒復(fù)制的半消除(quasi-extinction)。因此牛Mxl自此以后可同人ΜχΑ、野生小鼠Mxl和Mx2、大鼠Mxl和雞Mx—起包括在具有證實(shí)的抗流感活性的Mx蛋白的組內(nèi)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，通過(guò)人MxA同種型的轉(zhuǎn)基因表達(dá)體外賦予的抗流感保護(hù)系數(shù)總計(jì)達(dá)10\5.IO2或5.IO30無(wú)論何時(shí)在現(xiàn)有技術(shù)中體外測(cè)量小鼠Mxl抗流感活性，報(bào)告的保護(hù)系數(shù)總是總計(jì)達(dá)約103。雖然用于檢查雞Mx的抗流感活性的體外細(xì)胞制劑略有不同，但報(bào)告的保護(hù)系數(shù)大致為102。相反地，根據(jù)圖1，可看到由根據(jù)本發(fā)明的牛Mxl同種型提供的保護(hù)系數(shù)在IO5與IO8之間變化(取決于感染復(fù)數(shù))。因此牛Mxl被賦予比迄今測(cè)試的任何Mx蛋白的抗流感活性顯著更強(qiáng)的抗流感活性。實(shí)施例2(對(duì)照?qǐng)D2):牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白在被高致病性H5N1甲型流感病毒株感染的veix)細(xì)胞中顯示出比由豬和人Mxl發(fā)動(dòng)蛋白顯示的抗甲型流感病毒活性更強(qiáng)的抗甲型流感病毒活性在本實(shí)施例中，由智人、野豬和牛Mxl同種型的條件表達(dá)賦予的對(duì)甲型流感病毒復(fù)制的抗性的程度通過(guò)測(cè)量由不表達(dá)或表達(dá)所述Mxl同種型的VeiO細(xì)胞單層產(chǎn)生的48小時(shí)的甲型流感病毒產(chǎn)量來(lái)確定。用于人MxA(huMxA)和豬MxKpoMxl)的表達(dá)載體的構(gòu)建、允許所述Mx同種型的多西環(huán)素控制下的表達(dá)的VeiO細(xì)胞克隆的產(chǎn)生以及這些克隆的表征與先前對(duì)于牛Mxl所描述的方法基本上相似。對(duì)于每一個(gè)Mx同種型獲得一個(gè)克隆，即克隆VA8(huMxA)和VSK6(poMxl)。高致病性禽H5N1甲型流感病毒(A/crested_eagle/Belgium/l/2004)用于本研究。繁殖病毒，將原液在胚化期雞蛋中生長(zhǎng)，利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法測(cè)定其滴度。為了進(jìn)行感染，首先將原液等分試樣稀釋于具有O.2%BSA的DMEM中。即時(shí)制備系列稀釋物以產(chǎn)生具有適當(dāng)感染復(fù)數(shù)的體積匹配的接種物，將其摻入誘導(dǎo)的(多西環(huán)素)或非誘導(dǎo)的(媒介物)V103、VA8和VSK6細(xì)胞單層，靶感染復(fù)數(shù)為O.1、1和10。感染后，使接種物在37°C吸附60分鐘，然后通過(guò)用PBS充分洗滌將其除去。隨后將培養(yǎng)物在37°C于不含多西環(huán)素的DMEM/2中進(jìn)行溫育。在于37°C溫育48小時(shí)后，對(duì)培養(yǎng)物上清液進(jìn)行取樣，按一式三份利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法在雞成纖維細(xì)胞上測(cè)定病毒滴度。利用Reed-Muench法計(jì)算所有滴度。在其中嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)條件的本實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，由3種Mx同種型帶來(lái)的抗流感活性明顯不同(圖2)。事實(shí)上，牛Mxl的表達(dá)對(duì)甲型流感病毒復(fù)制的抑制為其它兩種的100至20000倍。因此牛Mxl被賦予比其它細(xì)胞質(zhì)Mx同種型的抗流感活性顯著更強(qiáng)的抗流感活性，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員不能預(yù)測(cè)的。實(shí)施例3:甲型流感病毒HlNl和H5N1肺炎的體內(nèi)小鼠模型病毒一使用2種用于實(shí)驗(yàn)室小鼠的低致病性甲型流感病毒進(jìn)化枝(clade)l禽H5N1病毒(A/crested_eagle/Belgium/l/2004)和豬HlNl病毒(A/swine/Iowa/4/1976)。首先在10日齡胚化期雞蛋的尿囊腔中繁殖兩種病毒，隨后通過(guò)肺對(duì)肺傳代(lung-to-lungpassaging)使其適合于小鼠。在每一次傳代，用50μI含有甲型流感病毒的尿囊液或肺勻漿物鼻內(nèi)接種一組小鼠。在接種后(Pi)第5天，通過(guò)施用過(guò)量戊巴比妥，然后放血來(lái)對(duì)小鼠進(jìn)行無(wú)痛致死，將肺組合，于PBS-青霉素-鏈霉素中勻漿，將勻漿物以3，OOOg離心10分鐘，將上清液用于下一次傳代。當(dāng)小鼠在接種后第3-4天以及之后變得明顯病態(tài)時(shí)，停止該方法。這在5次(Η5Ν1)或31次(HlNl)傳代后發(fā)生。將來(lái)自最后一次傳代的肺勻漿物進(jìn)行均質(zhì)處理，然后將其等分以用于致病性分型研究，利用標(biāo)準(zhǔn)噬斑(standardplaque)·(HlNl)或半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法(H5N1)測(cè)定其滴度。隨后在FVB/J小鼠中進(jìn)行每一個(gè)適應(yīng)的病毒原液的系列稀釋物的接種,按照Reed和Muench的方法計(jì)算50%小鼠致死劑量(MLD50)。致病性分型法一為了評(píng)估病毒誘導(dǎo)的致病性，通過(guò)滴注50μL稀釋的原液，利用10MLD50的病毒鼻內(nèi)接種兩個(gè)系列的FVB/J小鼠。每天監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化以評(píng)估病毒誘發(fā)的致病。在選擇的時(shí)間間隔，給一組小鼠過(guò)量服用戊巴比妥鈉，然后通過(guò)切開肱動(dòng)脈進(jìn)行放血。將來(lái)自5只小鼠的肺和心臟、肝、脾、胰腺、腎、腦和脂肪組織的碎片于4%中性緩沖的冰冷多聚甲醛中進(jìn)行固定，進(jìn)行常規(guī)處理，包埋在石蠟中以進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估。用蘇木精和伊紅或用過(guò)碘酸-希夫?qū)?微米切片進(jìn)行染色以進(jìn)行損傷檢測(cè)。為了進(jìn)行病毒檢測(cè)，利用鏈霉抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物免疫過(guò)氧化物酶法對(duì)切片進(jìn)行染色。將針對(duì)重組流感病毒核蛋白本單位制備的IgG-純化的多克隆兔抗血清用作一抗的來(lái)源，將綴合有HRP的抗-兔IgG用作二抗。利用過(guò)3-氨基-9-乙基-咔唑顯示氧化物酶，從而導(dǎo)致鮮紅色沉淀，用Mayer’s蘇木素對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染色。為了進(jìn)行病毒滴定，稱取來(lái)自5只小鼠的肺的重量，將其在ImlPBS中勻漿，隨后進(jìn)行澄清。將上清液用于通過(guò)噬斑或半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法進(jìn)行的病毒滴定。由于已顯示雙相呼吸模式(biphasicexpiratorypattern)的采用預(yù)告約24小時(shí)內(nèi)發(fā)生死亡，因此由于人道原因選擇該定性體征作為實(shí)驗(yàn)疾病的終點(diǎn)。在該終點(diǎn)日，對(duì)5只小鼠的肺取樣，稱重，將其勻漿物烘干以進(jìn)行干重測(cè)定。實(shí)驗(yàn)流感疾病的特征一分別從患病的豬(1976年于美國(guó))和從2003年從泰國(guó)走私的大冠鷲分離用于本研究的HlNl和H5N1甲型流感病毒株。兩個(gè)病毒株對(duì)于FVB/J小鼠都是非致病性的(MLD50>106PFU/TCID50)。在適應(yīng)后，它們?cè)贔VB/J小鼠中顯示相似的致病效果，即非常接近的MLD50值3.2PFU(對(duì)于HlNl株)和6.4TCID50(對(duì)于H5N1株)。這使得能夠進(jìn)行它們各自的病理特征的相關(guān)比較?？傊?，除在H5N1接種后身體況和呼吸功能快得多的惡化外，通過(guò)接種10MLD50引起的病毒相關(guān)致病、體重減輕和大體損傷對(duì)于兩種病毒是相似的，終點(diǎn)日對(duì)于H5N1-和HlNl-誘發(fā)的疾病分別是接種后第4天和第8天。病理過(guò)程在前2天(H5N1)或前4天(HlNl)總體上是無(wú)癥狀的，隨后產(chǎn)生一般體征例如逐漸緩慢、不太頻繁和更加不穩(wěn)定的自發(fā)移位(spontaneousdisplacement)和皺皮(ruffledcoat)。到接種后第3天(H5N1)或第5天(HlNl)，所有小鼠變得嗜眠并且突然展示呼吸性疾病的臨床癥狀，包括呼吸窘迫、呼吸困難和用力呼吸。在H5N1接種后，小鼠在48小時(shí)內(nèi)，從接種后第3天至終點(diǎn)日體重減輕10%。在HlNl后，體重減輕是急劇的并且還顯示二相性特征10%減輕發(fā)生在病毒接種與呼吸癥狀出現(xiàn)之間，另外20%在ARDS過(guò)程中發(fā)生。在HlNl疾病的終點(diǎn)日進(jìn)行的尸體解剖也顯示與大規(guī)模肺充血和實(shí)變的診斷一致的暗紫色碩大的無(wú)捻發(fā)音的肝樣肺。在H5N1-接種的小鼠中，終點(diǎn)肺是碩大的無(wú)捻發(fā)音的和彌散性梅灰色的，這表示具有大規(guī)模肺水腫的充血的診斷。終點(diǎn)肺重量與對(duì)照值相比較幾乎加倍，但該重量增長(zhǎng)在H5N1接種后僅24小時(shí)(最后一天)獲得，而肺重量在從HlNl接種后第4天至接種后終點(diǎn)日的96小時(shí)中逐漸增加(圖2)。來(lái)自H5N1-感染的小鼠的肺的終點(diǎn)干重對(duì)濕重比率(17.6%±1·1%)比來(lái)自HlNl-感染的小鼠的所述比率(21.4%±1·4%)低約22%。在心臟、肝、脾、腎、腦或內(nèi)臟周圍脂肪中未觀察到明顯的大體損傷。達(dá)到峰值病毒滴度所需的時(shí)間在病毒株之間沒(méi)有不同。然而對(duì)于H5N1，死亡在峰值肺病毒濃度時(shí)發(fā)生，HlNl相關(guān)疾病只有在4天后(病毒的清除已很明顯的時(shí)候)才變得致命。肺形態(tài)學(xué)的一些組織學(xué)改變對(duì)于兩種病毒是相同的。第一，在感染的第一天至最后一天損傷的清晰地形學(xué)延伸是可感覺(jué)的從終末細(xì)胞支氣管或鄰近氣道的肺泡離心擴(kuò)·散。表征稱為彌漫性肺泡損傷的組織病理學(xué)病況的滲出期(exsudativephase)的所有改變可定性地鑒定為肺泡毛細(xì)血管的強(qiáng)烈充血、具有邊緣的毛細(xì)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞、肺泡上皮的壞死、間質(zhì)和肺泡性水腫、透明膜以及(主要地)單核細(xì)胞對(duì)肺泡的侵入。在另一方面，我們既未觀察到肺泡的立方化(cuboidalization)(II型肺泡壁細(xì)胞的增生)，也未觀察到氣道上皮的增生或鱗狀化生。這表示極其快速的疾病進(jìn)展和/或II型肺泡壁細(xì)胞的幾乎完全消除。盡管存在這些相似性，當(dāng)匯集在最后一天從HlNl-和H5N1-感染的小鼠采集的肺組織樣品的切片時(shí)，不知曉他正在觀察哪種感染的檢查者很容易將一種病毒株與另一種病毒株區(qū)分。將肺損傷歸因于HlNl株的標(biāo)準(zhǔn)為(I)氣道上皮的更早和多得多的廣泛變性、壞死和脫屑，(2)支氣管周圍、細(xì)支氣管周圍、間質(zhì)和肺泡內(nèi)浸潤(rùn)的高得多的細(xì)胞密度，(3)圍繞小動(dòng)脈的單核細(xì)胞的致密套囊(densecuff)的存在，(4)少得多的廣泛肺泡性水腫，和(5)肺泡出血的稀少。相反地，由H5N1株引起的損傷可通過(guò)氣道上皮的晚期和僅輕微的退化改變、肺泡性水腫的程度、炎性浸潤(rùn)的極低細(xì)胞密度、大量肺泡出血病灶和肺小動(dòng)脈的異常出現(xiàn)(由于血管周水腫的碩大，其似乎已被從周圍組織分割出來(lái))來(lái)辨別。在另一方面，小動(dòng)脈未顯示浸潤(rùn)的單核細(xì)胞的任何套囊。一些血管壁也顯示肌肉層內(nèi)的出血。在H5N1感染的小鼠中，除了明顯地肝外，未發(fā)現(xiàn)檢查的其它器官具有任何組織病理學(xué)損傷。這些肝顯示多病灶壞死，壞死病灶由與少數(shù)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞混合的高嗜酸粒細(xì)胞固縮的和核破裂的肝細(xì)胞的聚集體組成。此類病灶也見于一些動(dòng)物的脾中。令人驚訝地，在H5N1-感染的動(dòng)物的整個(gè)肝中檢測(cè)到大量PAS陽(yáng)性小島(islet)，每一個(gè)與壞死病灶重疊。還在所有H5N1-感染的動(dòng)物的肝中觀察到小葉中心水腫的和粒狀的(接種后第2天)、小葉中心的(接種后第3天)和全小葉型的(接種后第4天)微泡脂肪變性模式。在它們的腎髓質(zhì)中，可看見間質(zhì)出血。免疫組織化學(xué)的結(jié)果在用相同病毒株感染的小鼠間是均一性的?？傮w上，它們顯示HlNl株在4至5天內(nèi)離心地群集在整個(gè)肺中，始于細(xì)支氣管，但仍然嚴(yán)格地限定在肺中。相反地，H5N1病毒在24-48小時(shí)內(nèi)占領(lǐng)整個(gè)肺，之后僅感染一些細(xì)支氣管，并且擴(kuò)散至肺、胰腺、腎、脾、腦和內(nèi)臟周圍的脂肪。HlNl病毒最初在接種后第3天可在支氣管和細(xì)支氣管的上皮中被檢測(cè)到。到第5天，所述病毒株更明顯并且也出現(xiàn)在鄰近氣道的區(qū)域的肺泡上皮中。到接種后第7天，可在幾乎所有支氣管和細(xì)支氣管的上皮中和肺的廣泛區(qū)域的肺泡上皮中檢測(cè)到病毒。在肺泡結(jié)構(gòu)中，染色顯示病毒在I型和II型肺泡壁細(xì)胞中和在肺泡巨噬細(xì)胞中。H5N1病毒從第2天開始可在細(xì)支氣管周圍肺泡中的一些2型肺泡壁細(xì)胞、一些間質(zhì)/肺泡巨噬細(xì)胞和陽(yáng)性肺泡附近的一些內(nèi)皮細(xì)胞中被檢測(cè)到。相反地，所檢查的非呼吸器官都未顯示任何陽(yáng)性細(xì)胞。到第3天，氣道上皮的染色仍然是極不連續(xù)的和有限的，然而肺泡上皮顯示更明顯的彌漫地分布在整個(gè)肺中的染色。在肝中，多個(gè)陽(yáng)性肝細(xì)胞巢可被檢測(cè)到，正與上述壞死PAS陽(yáng)性病灶相對(duì)應(yīng)。少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞也是陽(yáng)性的。在接種后第4天，肺泡上皮仍然被彌漫性染色，但遠(yuǎn)比接種后第3天明顯。細(xì)支氣管上皮的染色也是第一次可見，但并非所有細(xì)支氣管-事實(shí)上遠(yuǎn)非所有-顯示該染色。與I型肺泡壁細(xì)胞相比較，II型肺泡壁細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞更常見地為陽(yáng)性。腎和肝的外觀與第3天相同，具有更明顯的染色。此外，還檢測(cè)到病毒陽(yáng)性膠質(zhì)細(xì)胞、脾巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、郎格爾漢斯細(xì)胞的小島和腹膜脂細(xì)胞。實(shí)施例4:通過(guò)表達(dá)牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)小鼠先天免疫攜帶含有牛Mxl的BAC305L8的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生一通過(guò)組合來(lái)自一系列品系的可獲得的SNP數(shù)據(jù)(http://www.informatics,iax.org/)的計(jì)算機(jī)比較、內(nèi)含子10至外顯子11連接的PCR擴(kuò)增以及如Jin等人，1998；Vanlaere等人，2008中所述使用HhaI進(jìn)行的外顯子14的PCR-RFLV分析，第一次顯示了FVB/J小鼠在Mxl基因座上的Mxl+等位基因狀態(tài)。將純化的BACDNA以約2-4ng/l·!I的濃度溶解在顯微注射緩沖液(IOmMTris-HCl[pH7.5]，O.ImMEDTA,30μM精胺，70μM亞精胺，IOOmMNaCl)中，將其顯微注射入FVB/J胚泡的原核。隨后將這些胚泡植入假妊娠受體。通過(guò)用牛特異性Mxl引物進(jìn)行PCR對(duì)DNA進(jìn)行基因分型，來(lái)進(jìn)行所得的后代中BAC305L8轉(zhuǎn)基因的整合的篩選和進(jìn)一步種系傳遞(在將選擇的動(dòng)物與野生型FVB/J雜交后)的測(cè)試。350個(gè)后代中有11個(gè)包含至少一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因，其中9個(gè)被證明將其傳遞至下一代。通過(guò)進(jìn)一步交配獲得半合子和純合子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。分析F6動(dòng)物的插入的牛Mx基因的表達(dá)和功能研究。boMxlmRNA水平的分析一在標(biāo)準(zhǔn)化刺激(poly-1/C,15μg/kg,ip,24小時(shí))后，比較野生型與轉(zhuǎn)基因小鼠中的Mxl轉(zhuǎn)錄水平。將編碼boMxl-蛋白的mRNA的量針對(duì)內(nèi)源參照mRNA(編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，GAPDH)的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。cDNA樣品的產(chǎn)生一從野生型和轉(zhuǎn)基因7至8周齡雌性poly-1/C-刺激的小鼠獲得腦、肺和脾組織(50-100mg)。在TRIzol中單獨(dú)地對(duì)每一個(gè)組織樣品進(jìn)行勻漿以制備總mRNA。用TURBODNA酶(Ambion)在37。C處理每一個(gè)勻漿物30分鐘。隨后，通過(guò)將單獨(dú)的提取物匯合來(lái)產(chǎn)生品系和器官特異性總RNA提取物。在純化后，利用分光光度計(jì)(0D260/280和0D260/230，分別地在I.9—2.O和I.8—2.2的范圍內(nèi)，NanoDrop-1000/Isogen)測(cè)定每一個(gè)提取物的純度和濃度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢查mRNA完整性。隨后在50μg特異性18聚體寡核苷酸引物和SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶存在的情況下,在50°C逆轉(zhuǎn)錄每一個(gè)品系和器官特異性總RNA提取物的等分試樣(2μgRNA)，進(jìn)行60分鐘。DNA校準(zhǔn)器(calibrator)的產(chǎn)生一為了估計(jì)每一個(gè)樣品中每一個(gè)祀cDNA的拷貝數(shù)，必需產(chǎn)生包含已知靶拷貝數(shù)的校準(zhǔn)器。為此目的，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增每一個(gè)靶序列，純化并將其克隆入PCRII載體。隨后產(chǎn)生每一個(gè)靶的具有已知濃度的原液，通過(guò)將質(zhì)粒濃度(μg/μD除以質(zhì)粒的質(zhì)量(yg)來(lái)計(jì)算拷貝數(shù)(每ml)。為了進(jìn)行該計(jì)算，利用分光光度計(jì)(260nm處的0D)測(cè)定質(zhì)粒濃度，通過(guò)將質(zhì)粒的長(zhǎng)度(載體長(zhǎng)度[bp]+插入物長(zhǎng)度[bp])乘以核苷酸的質(zhì)量(1.09610_15[yg])來(lái)計(jì)算質(zhì)粒質(zhì)量。對(duì)于每一個(gè)靶，基于適當(dāng)?shù)脑旱?個(gè)稀釋度(對(duì)應(yīng)于δχΙΟ^δχΙΟ^δχΙΟ^δχΙΟ'δχΙΟ5和7.5x10s拷貝)構(gòu)建定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了進(jìn)行品系之間與器官之間的比較，將Mx轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目針對(duì)GAPDH轉(zhuǎn)錄物的相應(yīng)數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)時(shí)PCR—PCR混合物由IOOng/μI模板DNA(IμI)、70ηΜ引物(每種0.7μI)和12.5μIABsoluteTMBlueQPCRSYBRGreenROXMix(ABgene)組成，終體積為25μI。將混合物置于ABIPRISM7900ΗΤ熱循環(huán)儀中，在下列條件進(jìn)行擴(kuò)增在95°C初始變性15分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(在95°C變性15秒，在58°C退火延伸30秒)，隨后在72°C進(jìn)行終延伸30秒。按一式三份進(jìn)行所有轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增，對(duì)每一個(gè)RNA提取物進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的時(shí)期(session)。通過(guò)擺回至50°C，然后使溫度逐步升高至95°C來(lái)監(jiān)測(cè)每一個(gè)擴(kuò)增子的熔解曲線。熔解曲線分析總是顯示單一產(chǎn)物的存在。為了檢查假陽(yáng)性，對(duì)每一個(gè)模板和引物對(duì)運(yùn)行無(wú)逆轉(zhuǎn)錄和無(wú)模板的對(duì)照。boMxl蛋白水平的分析/提取一對(duì)于每一個(gè)取樣的小鼠品系和每一個(gè)組織(腦、心臟、腎、肝、肺和脾)，將來(lái)自5只poly-1/C-接觸的(15μg/g體重，在處死前24小時(shí))8周齡動(dòng)物的冷凍(-80°C)器官匯合，在液氮浴中用研棒和研缽將其研磨成成粉末。將每一個(gè)器官的約500mg粗制冷凍勻漿物重懸浮于600μI提取緩沖液(LLB，Eurogentec)中，渦旋2分鐘，然后保持在冰上。隨后對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理(在冰上進(jìn)行3次脈冰，每次30秒，間隔30秒)，在4°C以11，OOOxg離心10分鐘。將上清液在蛋白質(zhì)排斥劑涂覆的管(ProteinLoBindEppendorfTubes)中于-80。C忙存，使用BCAProteinAssay試劑盒測(cè)量總蛋白質(zhì)含量。boMxl蛋白水平的分析/免疫印跡一將相應(yīng)于50yg(脾)、70yg(肺)或250yg(腦)總蛋白質(zhì)的所得上清液的等分試樣加載至10%SDS-PAGE凝膠上，進(jìn)行電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上后，用含有0.1%Tween和10%牛血清白蛋白的Tris-緩沖鹽溶液封閉印跡30分鐘，隨后用小鼠抗血清(稀釋度1:1，000)在室溫下溫育I小時(shí)。利用綴合有HRP的豬抗-兔IgGF(ab’)2片段(稀釋度1:1，000，Dakocytomation)顯示免疫復(fù)合物，然后使用CN/DABSubstrate試劑盒(PierceBiotechnology)檢測(cè)過(guò)氧化物酶。利用FluorSMultiimagerCO)照相機(jī)系統(tǒng)和QuantityOne軟件(Bio-Rad)進(jìn)行光密度測(cè)定。boMxl蛋白水平的分析/ELISA—使用本單位制備的抗-牛Mxl兔抗血清(用于捕獲)、小鼠抗血清，然后綴合有HRP的多克隆兔-抗-小鼠-Ig(用于檢測(cè))和最后TMB轉(zhuǎn)換(作為酶活性的讀出參數(shù))開發(fā)了非競(jìng)爭(zhēng)性間接夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。首先，在4°C用100μI以1:1000稀釋于碳酸鹽緩沖液(100mM，pH9.5)中的兔抗血清涂鋪96孔孔Microlon600板，進(jìn)行過(guò)夜。隨后在37°C用250μI酪蛋白溶液(1%，于PBS中)將其封閉I小時(shí)。為了進(jìn)行boMxl含量測(cè)定，首先將孔在37°C用100μI校準(zhǔn)器(參見下文)或于PBS中稀釋的器官提取物溫育I小時(shí)，隨后在37°C用100μI于PBS-0.5%酪蛋白中以1:1000稀釋的小鼠抗血清溫育I小時(shí)。為了檢測(cè)免疫復(fù)合物，將孔在37°C用IOOyI于PBS-0.5%酪蛋白中以1:1000稀釋的兔抗-小鼠-Ig溫育I小時(shí)，隨后按照制造商的推薦，在室溫下用100μI的具有H2O2的底物緩沖液中的TMB溫育20分鐘。通過(guò)添加100μI的IMHCl終止顯色,將板在450nm處進(jìn)行讀數(shù)。測(cè)定相對(duì)于消減參照(subtractivereference)(相應(yīng)于來(lái)自受激野生型FVB/J小鼠的器官的提取物)的0D。校準(zhǔn)器來(lái)源于重組boMxl滴定的原液(100μg/ml)。使用的最高校準(zhǔn)濃度為375ng/ml，并且將該溶液在PBS中經(jīng)歷9步驟系列稀釋。所得的校準(zhǔn)樣品的濃度如下375、250、200、150、100、80、60、40、20和IOng/ml。對(duì)于每一個(gè)時(shí)期的組織boMxl含量測(cè)量，從原液產(chǎn)生新的校準(zhǔn)器。它們提供信號(hào)對(duì)濃度(ngboMxl/μg可溶性蛋白)的絕對(duì)關(guān)系。首先測(cè)定來(lái)自每一個(gè)器官的原始蛋白質(zhì)提取物的連續(xù)稀釋物以測(cè)定產(chǎn)生最高信號(hào)的濃度范圍。稀釋脾、肺和腦蛋白質(zhì)提取物以分別摻入每孔5、50和300μg總蛋白質(zhì)。boMxl蛋白水平的分析/免疫組織化學(xué)一按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行組織取樣。在于4%中性緩沖的冰冷多聚甲醛中固定和在石蠟中包埋后，使用兔抗血清，然后利用綴合有HRP的山羊-抗-兔免疫球蛋白二抗，通過(guò)間接免疫組織學(xué)方法對(duì)組織切片進(jìn)行染色以檢測(cè)boMxlo利用3-氨基-9-乙基-咔唑顯示過(guò)氧化物酶,產(chǎn)生鮮紅色沉淀。利用Mayer’s蘇木精對(duì)組織進(jìn)行復(fù)染色，將其包埋在甘油-明膠中。將兔免疫前血清、省略切片(omissionsection)和模擬物接觸的MDBK細(xì)胞離心涂片器(cellcytospin)用作陰性對(duì)照，將與IFNci-接觸的MDBK細(xì)胞離心涂片器用作陽(yáng)性對(duì)照。檢查了下列組織肺、心臟、腸、肝、脾、腎、大腦、小腦和腦干。boMx蛋白的功能分析一通過(guò)檢查水皰性口炎病毒(VSV)、彈狀病毒的生物學(xué)周期在轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中是否被改變來(lái)探測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對(duì)小鼠抗RNA病毒的先天免疫的調(diào)節(jié)。從病毒感染的BHK-21細(xì)胞的上清液制備VSV血清型Indiana的原液和適當(dāng)?shù)南♂屛?。首先進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的體外實(shí)驗(yàn)，其中以0.1、1或10的感染復(fù)數(shù)將病毒懸浮液摻入(300μI/孔，24-孔板)非誘導(dǎo)的或誘導(dǎo)的(50μg/mlpoly-1/C進(jìn)行24小時(shí))MEF品系(其來(lái)源于野生型(WT)、轉(zhuǎn)基因低表達(dá)和轉(zhuǎn)基因高表達(dá)FVB/J小鼠)的接近匯合的(80%)培養(yǎng)物，進(jìn)行I小時(shí)。在I小時(shí)的吸收期后，通過(guò)用PBS洗滌除去過(guò)量接種物，將培養(yǎng)物在37°C新鮮DMEM中再溫育24小時(shí)。隨后對(duì)培養(yǎng)上清液取樣以用于病毒滴定。為了進(jìn)行體內(nèi)研究，通過(guò)在麻醉(30/5mg.kg4賽拉嗪/氯胺酮，ip)下將50μI的病毒懸浮液(即廣IO7的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量[CCID5J)緩慢地滴入鼻孔來(lái)用病毒接種15只WT、10只ML-555和15只ML-549FVB/J小鼠的組。在所有組中，監(jiān)測(cè)體重和存活，進(jìn)行14天。在接種后第4天，無(wú)痛致死5只WT和5只ML-549小鼠的亞組。取出它們的肺和腦，利用TissueLyser進(jìn)行勻漿以進(jìn)行隨后的病毒滴定。首先按一式二份在VeiO細(xì)胞上測(cè)定上清液和器官懸浮液的病毒滴度。如先前所述(Baise等人，2004:ConditionalexpressionoftypeIinterferon-inducedbovineMxlGTPaseinastabletransgenicverocelllineinterfereswithreplicationofvesicularstomatitisvirus.JInterferonCytokineRes.2004Sept.24(9)，pp.513-521)，在接種后48小時(shí)，它們以CCID50單位表達(dá)。也通過(guò)實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行病毒載量的相對(duì)定量。按照制造商的說(shuō)明書(Macherey-Nagel)，借助于商購(gòu)可得的NucleoSpin基于二氧化硅的離心柱提取總RNA。在獨(dú)立的逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟中，將2μg提取的RNA添加至補(bǔ)充有25pmol隨機(jī)六聚體引物(AppliedBiosystems)、5nmoldNTP、55nmolMgCl2、4IURNA酶抑制劑和12.5IUMultiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶(AppliedBiosystems)的IXMultiscribeRT緩沖液(TaqIVlan逆轉(zhuǎn)錄試劑，AppliedBiosystems)中，總體積為10μI。RT條件如下在25°C進(jìn)行10分鐘，然后在48°C進(jìn)行30分鐘以及在95°C進(jìn)行5分鐘。為了進(jìn)行隨后的實(shí)時(shí)PCR，將5μI模板cDNA添加至12.5μI的補(bǔ)充有5pmol正向和反應(yīng)引物的2XSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems),總體積為25μI。將該混合物置于ABI7900ΗΤ熱循環(huán)儀中，在95°C進(jìn)行10分鐘，隨后利用程序擴(kuò)增被靶向的VSV-特異性cDNA區(qū)段，所述程序由40個(gè)如下的循環(huán)組成在95°C進(jìn)行15秒和在60°C進(jìn)行60秒。通過(guò)擺回至50°C進(jìn)行15秒，然后使溫度逐步升高至95°C來(lái)監(jiān)測(cè)所得的擴(kuò)增子的熔解曲線。將VSV-陽(yáng)性樣品和陰性含水樣品包括在內(nèi)，作為RT和PCR步驟中的內(nèi)部對(duì)照。按一式二份反應(yīng)分析所有樣品。具有表達(dá)功能性牛Mxl的插入物的轉(zhuǎn)基因小鼠品系的表征一染色體16上的位置97668642與97684514(Mxl基因)之間可獲得的SNP數(shù)據(jù)未顯示一方面的FVB/J品系與另一方面的BALB/c、C57BL/6、DBA/2和C3H/HeN品系之間的變異。此外通過(guò)PCR從BALB/C-A2G小鼠但未從BALB/c、FVB/J和ML-549品系回收到與內(nèi)含子10和外顯子11重疊的基因組片段。外顯子14的PCR-RFLV分析顯示HhaI限制酶切位點(diǎn)存在于所有測(cè)試的品系中，這反駁了FVB/J中存在CBA/J-樣Mxl+等位基因的假設(shè)。結(jié)合起來(lái)，這些結(jié)果顯示FVB/J品系具有大部分近交系共有的Mxl-陰性等位基因。11只通過(guò)顯微注射的卵母細(xì)胞的輸卵管轉(zhuǎn)移出生的小鼠是轉(zhuǎn)基因的。這些小鼠中的9只將轉(zhuǎn)基因傳遞給它們的后代，如通過(guò)PCR分析顯示的，但9個(gè)品系中的2個(gè)品系因極低的生殖率而快速滅絕。隨后，利用標(biāo)準(zhǔn)PCR進(jìn)行的更詳細(xì)的分析使我們能夠從7個(gè)剩余品系的DNA擴(kuò)增相應(yīng)于boMxl基因的5’和3’末端的特定區(qū)段。這表明在每一個(gè)品系中插入了至少一個(gè)牛Mxl基因的完整拷貝。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，然后通過(guò)實(shí)時(shí)PCR在來(lái)自poly-1/C-注射的小鼠的肺組織中測(cè)量到最高水平的boMxlmRNA。將它們針對(duì)GAPDHmRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該分析顯示插入的boMxl基因在所有品系的肺中高效轉(zhuǎn)錄。按照所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的量，可將轉(zhuǎn)基因品系容易地分類為高表達(dá)(ML-549、ML-556)、中等表達(dá)(ML-310、ML-375)或低表達(dá)品系(ML-312、ML-545和ML-555)。通過(guò)RT-PCR從poly-1/C-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠回收的boMxl多核苷酸序列的計(jì)算機(jī)翻譯產(chǎn)生了預(yù)期的氨基酸序列。肺、脾和腦提取物的Western印跡(免疫印跡)分析(數(shù)據(jù)未顯示)顯示boMxlmRNA在所有三種組織中的確被翻譯。從3只小鼠的肺獲得的3個(gè)印跡的半定量密度計(jì)分析產(chǎn)生與通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定的相同的按表達(dá)水平的分類ML-549~ML-556>ML-310^ML-375>ML-312^ML-545^ML-555(圖2B)。腦、心臟、肺、腸、腎、肝和脾組織的免疫組織化學(xué)分析確認(rèn)了這些結(jié)果，并且進(jìn)一步顯示表達(dá)在器官間和器官內(nèi)的差異。在除了一個(gè)品系(ML-545，其組織未顯示染色)外的所有轉(zhuǎn)基因品系的所有小鼠中，boMxl-特異性染色在腎和腸中比在其它器官中強(qiáng)。在腦和肝中，其在一些細(xì)胞類型(Kupffer細(xì)胞)或結(jié)構(gòu)(脈絡(luò)叢)中更強(qiáng)；在肺中，染色在肺泡的上皮中比在細(xì)支氣管的上皮中更強(qiáng)。我們使用ELISA來(lái)測(cè)量boMxl蛋白在每一個(gè)品系的5只poly-1/C預(yù)處理的小鼠的不同器官中的濃度。對(duì)于品系ML-545，無(wú)論動(dòng)物或器官是什么，結(jié)果與野生型小鼠的器官的結(jié)果相同。在6個(gè)產(chǎn)生boMxl的品系之間，未出現(xiàn)清晰的表達(dá)模式，雖然就濃度而言主導(dǎo)趨勢(shì)是脾中的濃度約為肺中的15倍，肺中的濃度約為腦中的5倍。在肺中，4個(gè)品系顯示200-300ng/mg可溶性蛋白的濃度，另外兩個(gè)品系顯示約100ng/mg可溶性蛋白的濃度?；谀X中的濃度，3對(duì)是可鑒定的ML-549和ML-556具有約50ng/mg可溶性蛋白，ML-310和ML-375具有15_25ng/mg可溶性蛋白，ML-312和ML-375具有約5ng/mg可溶性蛋白。對(duì)于脾濃度，出現(xiàn)2個(gè)高表達(dá)(5μg/mg可溶性蛋白)、2個(gè)低表達(dá)和2無(wú)表達(dá)品系。其中后者為品系ML-310,在肺中具有高boMxl水平但在脾中不存在。在利用poly-1/C進(jìn)行最大刺激后，來(lái)自ML-549和ML-555小鼠的第5代胚胎成纖維細(xì)胞表達(dá)約I.4和O.2μgboMxl/mg可溶性蛋白。我們的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞系(其顯示高度的VSV抗性(Baise等人，2004))包含約Iμg/mg，牛BT和MDBK細(xì)胞系分別產(chǎn)生約I和約O.6μg/mg。為了進(jìn)行比較，我們還進(jìn)行了在當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)和尸檢臨床學(xué)院(Facultynecropsyclinic)收集的牛脾的boMxl含量的大規(guī)模篩選。這顯示了其中未檢測(cè)到病毒的被屠宰的動(dòng)物之間和尸檢動(dòng)物之間的約O.15μg/mg可溶性蛋白的自發(fā)(從而次于最大的)濃度，然而boMxl濃度在10個(gè)病毒陽(yáng)性案例之間總計(jì)達(dá)O.5至3yg/mgo總而言之，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠，所述轉(zhuǎn)基因小鼠不存在內(nèi)源抗病毒Mx蛋白(它們的遺傳背景為FVB/J品系的遺傳背景)，但在不同器官中并且在它們天然啟動(dòng)子的控制下條件化表達(dá)牛Mxl基因，達(dá)到可與牛細(xì)胞和組織中測(cè)量的蛋白質(zhì)濃度相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度。表達(dá)完整牛Mxl基因的轉(zhuǎn)基因小鼠被保護(hù)免受致命VSV感染一通過(guò)使用體重減輕作為病狀的量度，我們于是檢查牛Mxl基因是否能夠保護(hù)轉(zhuǎn)基因小鼠免受致命VSV感染。我們觀察到在Io7CCID5tl的病毒下，轉(zhuǎn)基因boMx+/_ML-549小鼠未經(jīng)歷任何顯著的體重減輕，然而轉(zhuǎn)基因boMx+/_ML-555和野生型小鼠在接種后體重顯著下降。這些小鼠之間的存活隨訪顯示一方面的ML-549小鼠與另一方面的ML-555和野生型小鼠之間的高度顯著的差異(Kaplan-Meier分析，p〈0.01);所有ML-549小鼠存活，然而在兩個(gè)其它品系之間死亡率分別為100和70%?？偠灾?表達(dá)兩種牛Mxl的小鼠被保護(hù)而免受由VSV病毒引起的高死亡率和發(fā)病率。為了測(cè)試“該boMxl-誘導(dǎo)的臨床嚴(yán)重度的降低與病毒本身的抑制相關(guān)”這一假設(shè)，我們通過(guò)qPCR和常規(guī)滴定定量VSV病毒載量。VSV感染后4天，VSV基因組載量在野生型小鼠的肺中顯著高于ML-549小鼠，如從來(lái)自后者的樣品的增加的循環(huán)閾值判斷的。腦是鼻內(nèi)感染后VSV的另一個(gè)靶器官。在感染后第4天，從100%的野生型小鼠，但僅從50%的ML-549小鼠中回收到VSV基因組，qPCR-陽(yáng)性樣品的比較顯示在ML-549小鼠中存在較低的水平。我們還測(cè)量了接種后4天小鼠的肺和腦組織中VSV的復(fù)制。所有小鼠的腦中發(fā)現(xiàn)的病毒滴度在該時(shí)間點(diǎn)上低于我們的測(cè)定的檢測(cè)限。在所有野生型小鼠的肺(4.17±0.65[-1]IogTCID50)中，但未在轉(zhuǎn)基因小鼠肺中檢測(cè)到病毒?？偟貋?lái)說(shuō)，牛Mxl基因在小鼠中的表達(dá)對(duì)于在VSV感染后減少肺中的病毒載量是至關(guān)重要的。在用VSV感染胚胎成纖維細(xì)胞單層后24小時(shí)，ML-549中的基因組拷貝數(shù)和感染性顆粒載量再次顯著低于野生型來(lái)源的細(xì)胞。實(shí)施例5:表達(dá)小家鼠和牛Mxl的胚胎小鼠成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生從交配后14天的胚胎收獲來(lái)自同基因型的BALB/C-A2G和ML549、ML-555和ML556轉(zhuǎn)基因小鼠的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)。首先分割頭、肝和腸，將余下的胎兒組織切碎，然后于PBS中進(jìn)行漂洗。隨后用胰蛋白酶(0.25%，于Dulbecco’sPBS中)處理胎兒勻漿物，在37°C溫育30分鐘，隨后在培養(yǎng)基中進(jìn)行離解。在除去可看見的組織團(tuán)塊后，將剩余的細(xì)胞涂鋪在裝有補(bǔ)充有10%熱滅活的FCS、1%(ν/ν)青霉素-鏈霉素和0.5%兩性霉素B的DMEM的25-cm2培養(yǎng)瓶中。在4小時(shí)的接種后，通過(guò)輕輕混合除去非粘附性細(xì)胞，然后直接更換培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)物在約60小時(shí)后達(dá)到匯合，將其以1:2分傳以用于在液氮中冷凍(第I代MEF)或用于涂鋪在175-cm2培養(yǎng)瓶中。為了進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)，大約每4天以1:4分傳MEF培養(yǎng)物。實(shí)施例6(對(duì)照?qǐng)D3):牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白在用高致病性H5N1甲型流感病毒株感染的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中顯示出比由moMxl發(fā)動(dòng)蛋白顯示的抗甲型流感病毒活性更強(qiáng)的抗甲型流感病毒活性在用甲型流感病毒的A/crested_eagle/Belgium/l/2004H5N1株以KT1的感染復(fù)數(shù)接種之前24小時(shí)，用poly-1/C刺激來(lái)源于純合同基因型的BALB/c_A2G和表達(dá)轉(zhuǎn)基因boMxl的ML555、ML549和ML556小鼠品系的原代胚胎成纖維細(xì)胞的單層。在接種后48小時(shí)，利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法，將上清液用于病毒滴定。結(jié)果收集在圖3中。與表達(dá)小鼠-Mxl的MEF相比較，表達(dá)生理水平的boMxI的小鼠(來(lái)源于轉(zhuǎn)基因ML549品系)賦予了顯著更好的保護(hù)作用，具有19%的下降。此外，生理水平的小鼠Mxl賦予在數(shù)量上與來(lái)源于ML555品系(即，先前已顯示表達(dá)在源物種中表達(dá)的Mxl的量的1/10的品系)的MEF賦予的相似程度的對(duì)病毒復(fù)制的抗性。這些結(jié)果顯示boMxl對(duì)病毒生命周期的阻斷比由小鼠Mxl賦予的要強(qiáng)得多。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，在體外通過(guò)表達(dá)人MxA賦予的抗流感保護(hù)系數(shù)總計(jì)達(dá)10\5.IO2或5.103，小鼠的Mxl達(dá)103，以及雞Mx的達(dá)102。因此，由牛Mxl賦予的保護(hù)作用是前所未有的。實(shí)施例7(對(duì)照?qǐng)D4):牛Mxl的體內(nèi)表達(dá)在實(shí)驗(yàn)室小鼠中抑制由甲型流感病毒H5N1感染引起的組織學(xué)改變?cè)?0日齡胚化期雞蛋的尿囊腔中繁殖進(jìn)化枝I禽H5N1病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)，隨后通過(guò)肺對(duì)肺傳代使其適應(yīng)小鼠。在每一代，用50μI含有甲型流感病毒的尿囊液或肺勻漿物鼻內(nèi)接種一組小鼠。在接種后第5天，無(wú)痛致死小鼠，將它們的肺組合，于PBS-青霉素-鏈霉素中進(jìn)行勻漿，將勻漿物離心，將上清液用于下一次傳代。當(dāng)小鼠在第5代后在接種后第3-4天以及之后變得明顯病態(tài)時(shí)，停止該方法。將來(lái)自最后一代的肺勻漿物進(jìn)行均質(zhì)處理，然后將其等分以用于進(jìn)一步致病性分型研究，并且利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法(CCD50)來(lái)測(cè)定它們的滴度。為了評(píng)估病毒相關(guān)損傷，通過(guò)在麻醉(30/5mg.k^1賽拉嗪/氯胺酮，ip)下將50μI的每一種稀釋物緩慢地滴入鼻孔來(lái)在野生型FVB/J小鼠中和ML-549品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行適應(yīng)的病毒原液的標(biāo)準(zhǔn)稀釋物的接種。在選擇的時(shí)間間隔上，給5只小鼠過(guò)量施用戊巴比妥鈉，然后通過(guò)切開肱動(dòng)脈進(jìn)行放血。將肺于4%中性緩沖的冰冷多聚甲醛中進(jìn)行固定，進(jìn)行常規(guī)處理，包埋在石蠟中以進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估。用蘇木精和伊紅對(duì)5微米切片進(jìn)行染色。在野生型FVB/J小鼠的Η5Ν1疾病的終點(diǎn)日進(jìn)行的尸體解剖始終顯示碩大的無(wú)捻發(fā)音的和彌漫性梅灰色肺(表示大規(guī)模肺水腫充血的診斷)。相反地，來(lái)自表達(dá)boMxl的小鼠的肺與來(lái)自在健康的無(wú)特定病原體的FVB/J小鼠中取樣的肺相比較未顯示任何改變。在組織學(xué)上，來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠的肺與來(lái)自健康小鼠的肺相似(圖4)。相反地，在野生型FVB/J小鼠中，看到許多改變，在感染的第一天至最后一天損傷的清晰地形學(xué)延伸是可覺(jué)察的從終末細(xì)胞支氣管或鄰近氣道的肺泡離心擴(kuò)散(圖4)。表征稱為彌漫性肺泡損傷的組織病理學(xué)病況的滲出期的所有改變可定性地鑒定為肺泡毛細(xì)血管的強(qiáng)烈充血、具有邊緣的毛細(xì)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞、肺泡上皮的壞死、間質(zhì)和肺泡性水腫、透明膜以及(主要地)單核細(xì)胞對(duì)肺泡的侵入。在另一方面，我們既未觀察到肺泡的立方化(II型肺泡壁細(xì)胞的增生)也未觀察到氣道上皮的增生或鱗狀化生。這表示極其快速的疾病進(jìn)展和/或II型肺泡壁細(xì)胞的幾乎完全消除。由于血管周水腫的碩大，肺小動(dòng)脈似乎已被從周圍組織分割出來(lái)，一些血管壁還顯示肌肉層內(nèi)部的出血。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，在用高毒力甲型流感病毒感染后由Mx蛋白賦予的抗肺損傷的發(fā)展的保護(hù)作用從來(lái)不是完全的，包括在表達(dá)它們的內(nèi)源抗病毒同種型的小鼠中。因此，在表達(dá)boMxl的小鼠中觀察到的肺改變的不存在是前所未有的，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員不能預(yù)測(cè)的。實(shí)施例8(對(duì)照?qǐng)D5):實(shí)驗(yàn)小鼠的甲型流感病毒H5N1感染在表達(dá)boMxl-發(fā)動(dòng)蛋白的小鼠間導(dǎo)致比表達(dá)moMxI-發(fā)動(dòng)蛋白的小鼠間更低的死亡率在10日齡胚化期雞蛋的尿囊腔中繁殖進(jìn)化枝I禽H5N1病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)，隨后通過(guò)肺對(duì)肺傳代使其適應(yīng)小鼠。在每一代，用50μI含有甲型流感病毒的尿囊液或肺勻漿物鼻內(nèi)接種一組小鼠。在接種后第5天，無(wú)痛致死小鼠，將它們的肺組合，于PBS-青霉素-鏈霉素中進(jìn)行勻漿，將勻漿物離心，將上清液用于下一次傳代。當(dāng)小鼠在第5代后在接種后第3-4天以及之后變得明顯病態(tài)時(shí)，停止該方法。將來(lái)自最后一代的肺勻漿物進(jìn)行均質(zhì)處理，然后將其等分以用于進(jìn)一步致病性分型研究，利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法(CCD50)測(cè)定它們的滴度。為了評(píng)估病毒相關(guān)致死率，通過(guò)在麻醉(30/5mg.k^1賽拉嗪/氯胺酮，ip)下將50μI的每一種稀釋物緩慢地滴入鼻孔而在野生型FVB/J小鼠中和BALB/c小鼠中，在同基因型的BALB/c_A2G小鼠中和在ML-555和ML-549品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行適應(yīng)的病毒原液的6個(gè)10倍系列稀釋物的接種。在所有組中，監(jiān)測(cè)存活，進(jìn)行14天。根據(jù)Reed和Muench的方法計(jì)算半數(shù)小鼠致死劑量(MLD50)。5個(gè)組群的小鼠的特征性LD50如下對(duì)于FVB/J、BALB/c、BALB/c_A2G、FVB/J-ML555和FVB/J-ML549分別為6.4、20、12649,27252和>40000CCID50。4.IO4CCID50的接種在表達(dá)不同Mx同種型/量的小鼠品系之間產(chǎn)生明確的差異(圖5)。FVB/J和BALB/c存活曲線在統(tǒng)計(jì)上相似(時(shí)序檢驗(yàn)，p>0.I)，但與3個(gè)表達(dá)Mx的品系的典型存活線明顯不同(p〈0.003)。盡管事實(shí)上同基因型的BALB/C-A2G和轉(zhuǎn)基因FVB/J-ML549小鼠分別表達(dá)生理水平的小鼠和牛Mxl，但它們的存活曲線顯著不同(p〈0.002)，這顯示了牛Mxl被賦予更強(qiáng)的抗流感活性。最后，低表達(dá)轉(zhuǎn)基因FVB/J-ML-555和同基因型BALB/c_A2G的典型存活曲線在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(p>0.6)，因此顯示了少量牛Mxl足以模擬由生理水平的小鼠Mxl產(chǎn)生的抗流感活性。實(shí)施例9(參照?qǐng)D6):實(shí)驗(yàn)室小鼠的甲型流感病毒H5N1感染導(dǎo)致表達(dá)boMxl-發(fā)動(dòng)蛋白的小鼠間的死亡率低于表達(dá)moMxI-發(fā)動(dòng)蛋白的小鼠間的死亡率為了評(píng)估H5N1甲型流感病毒相關(guān)病狀，在野生型FVB/J和BALB/c小鼠中，在同基因型BALB/C-A2G小鼠中和在ML-555和ML-549品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行4.IO4CCID50的適應(yīng)的病毒原液的鼻內(nèi)接種，每天監(jiān)測(cè)它們的體重減輕或增長(zhǎng)，進(jìn)行I周(圖6)。身體狀況在Mx-陰性品系(FVB/J和BALB/c)間惡化快得多，最終達(dá)到13至19%的體重減輕；Mx-陰性品系通常顯示3天的中等存活持續(xù)時(shí)間。相反地，在轉(zhuǎn)基因品系FVB/J-ML-549的小鼠間未發(fā)生明顯的體重減輕。再次地，兩個(gè)剩余的品系顯示中間特征，同基因型BALB/C-A2G小鼠間的體重的連續(xù)減輕最終達(dá)到接種后7天約15%的減輕，并且對(duì)于低表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠為雙峰特征，持續(xù)5天的連續(xù)減輕(-10%)和之后趨向恢復(fù)。這些病狀特征與由各自Mxl同種型提供的身體狀況的完全保護(hù)作用、部分保護(hù)作用和無(wú)保護(hù)作用是一致的。兩個(gè)表達(dá)生理水平的小鼠和牛Mx的小鼠品系的比較確認(rèn)了存活數(shù)據(jù)，并且強(qiáng)調(diào)了牛Mxl在抗-病毒活性方面的優(yōu)越性。實(shí)施例10(參照?qǐng)D7):實(shí)驗(yàn)室小鼠的甲型流感病毒H5N1感染導(dǎo)致表達(dá)boMxl的小鼠間的肺病毒載量比表達(dá)moMxl的小鼠間的低為了評(píng)估H5N1甲型流感病毒在小鼠肺中的復(fù)制速率，在野生型FVB/J和BALB/c小鼠中，在同基因型BALB/C-A2G小鼠中和在ML-555和ML-549品系的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行適應(yīng)的病毒原液的4.IO4CCID50的鼻內(nèi)接種，從接種后(Pi)3天直至接種后6天每天測(cè)定肺病毒滴度(圖7)。為了進(jìn)行滴定，將5只小鼠的肺在ImlPBS中進(jìn)行勻漿，然后進(jìn)行澄清。利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法將上清液用于病毒滴定。為了測(cè)試“存活和病狀的Mx-相關(guān)模式與病毒本身的抑制相關(guān)”這一假設(shè)，我們利用常規(guī)滴定來(lái)定量H5N1肺病毒載量。在接種后3天，F(xiàn)VB/J-ML549轉(zhuǎn)基因小鼠中的肺H5N1感染性顆粒載量顯著低于任何其它株系/品系。此外，在這些小鼠中到接種后5天(在該時(shí)間點(diǎn)上，BALB/c-A2G的肺仍然具有很重的載量)，病毒已被清除?？傮w上，牛Mxl的表達(dá)強(qiáng)勁地抑制了H5N1甲型流感病毒復(fù)制，從而允許在4天后消除感染，對(duì)于小鼠Mxl情況并非如此。實(shí)施例11(參照?qǐng)D8):牛Mxl的N末端區(qū)段增強(qiáng)人和牛MxGED的抗流感活性表汰質(zhì)粒使用下列引物對(duì)(i)5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQIDNO:18)和5’-ACTGGAAAGCCCCAAAAT-3’(SEQIDNO:19)(用于產(chǎn)生人MxA的N末端片段)，(ii)5’_CCTCGACTGTGCCTTCTA-3，(SEQIDNO:20)和5，-AGAGMGGAGCTGGAAGAAG-3，(SEQIDNO:21)(用于產(chǎn)生人MxA的GED-編碼片段)，(iii)5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQIDNO:22)和5’-GGATTGGAAGTAATGGTTTG-3’(SEQIDNO:23)(用于產(chǎn)生牛Mxl的N末端片段)和(iv)5’-CCTCGACTGTGCCTTCTA-3’(SEQIDNO:24)和5’-AGAGAAGGAGGCAGAAGAAG-3’(SEQIDNO25)(用于產(chǎn)生牛Mxl的GED-編碼片段)，利用根據(jù)Wurch等人(1998)和Nagy等人(1996)(Wurch等人AmodifiedoverlapextensionPCRmethodtocreatechimericgenesintheabsenceofrestrictionenzymes.BiotechnologyTechniques,12:653-657,1998.；Nagy等人！Assemblingandcloninggenesforfusionproteinsusingreversetranscriptionone-stepoverlapextensionPCRmethod.AnalBiochem2006,351311-313.)的重疊延伸PCR，從前述pcDNA4-boMxl和pcDNA4_huMxA構(gòu)建編碼嵌合牛/人(huN/GEDbo)和人/牛(boN/GEDhu)Mx蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)和感染使用由50μIMEM、IμITransfectin和50μIMEM組成的轉(zhuǎn)染混合物，按照基本如制造商所描述的Transfectin技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,所述50μIMEM已包含各0.75μg的每一種質(zhì)粒DNA(pcDNA4/T0-eGFP用作對(duì)照，pcDNA4-huMXA、pcDNA4-boMXl、pcDNA4_boN/GEDhu、pcDNA4-huN/GEDbo和pcDNA4/eGFP用作實(shí)驗(yàn)組)。簡(jiǎn)而言之，將Vero細(xì)胞接種在24孔板中，生長(zhǎng)過(guò)夜至70%-80%的匯合。隨后，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，用200μIMEM/孔替換培養(yǎng)基，緩慢地將100μI轉(zhuǎn)染混合物摻入每一個(gè)孔中。首先將豬HlNl甲型流感病毒株在Vero上生長(zhǎng)以產(chǎn)生原液，將其等分，于-80°C貯存。通過(guò)將在補(bǔ)充有0.2%BSA和2μg/ml胰蛋白酶-TPCK的DMEM中稀釋原液的等分試樣來(lái)即時(shí)制備感染混合物。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用PBS充分洗滌細(xì)胞3次，將感染混合摻入每一個(gè)孔中，靶感染復(fù)數(shù)約為I。Mx蛋白和甲型流感病毒的共檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)染-感染的Vero細(xì)胞進(jìn)行雙免疫標(biāo)記以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)檢測(cè)Mx蛋白和甲型流感病毒核蛋白(NP)。在感染后5小時(shí)，通過(guò)胰蛋白酶消化收獲VeiO細(xì)胞，將其以300g沉淀15分鐘。將細(xì)胞在4°C用PBS中的4%(w/v)的多聚甲醛固定30分鐘，在已向其中添加了O.2%(w/v)皂苷的PBS中進(jìn)行透化，在室溫下于PBS、0.2%皂苷和l%(w/v)BSA中封閉I小時(shí)。隨后將細(xì)胞與一抗(即兔抗-huMXA和兔抗-boMxl抗血清以及抗-NPmAb)的混合物一起在37°C溫育45分鐘。在3個(gè)洗滌步驟后，將細(xì)胞與綴合有Alexa467(NP)或488(Mx)的相關(guān)二抗一起在37°C溫育。最后將免疫標(biāo)記的細(xì)胞重懸浮于PBS中，利用BD-Canto流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，對(duì)前向散射和側(cè)向散射進(jìn)行門控以排除碎片并且收集FL-I和FL-5中的熒光。獲得最少IO4個(gè)事件，利用BDFACSDiva軟件v4.I.I進(jìn)行分析。BoMxlN末端區(qū)段增強(qiáng)人和牛GED的抗流感活性鑒于在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)之間在非表達(dá)細(xì)胞間存在感染率的重現(xiàn)性(圖8)，無(wú)論試驗(yàn)性摻入的質(zhì)粒是什么，轉(zhuǎn)染方法本身等同地影響轉(zhuǎn)染的/感染的細(xì)胞群體。此外，由于表達(dá)eGFP的細(xì)胞的感染率傾向于高于非表達(dá)細(xì)胞的感染率，因此推斷出轉(zhuǎn)導(dǎo)方法本身不改變被研究的細(xì)胞制劑中的病毒生命周期。因此表達(dá)Mx的細(xì)胞群體間NP陽(yáng)性細(xì)胞的系統(tǒng)性耗盡(p<0.05)可歸因于Mx蛋白本身。在這些Mx蛋白當(dāng)中，boMxI如所預(yù)期的引起最強(qiáng)的抑制。當(dāng)將牛GED移植在人MxA的N末端區(qū)段上(嵌合huN/GEDbo)時(shí)，抗流感活性顯著降低但未被抵制。相反地，當(dāng)用牛Mxl的N末端區(qū)段置換人MxA的N末端區(qū)段(嵌合boN/GEDhu)時(shí)，抗流感活性得到顯著增強(qiáng)。綜合起來(lái)，收集的數(shù)據(jù)顯示牛Mxl的N末端區(qū)段顯著增強(qiáng)GED依賴性抗流感活性，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員從現(xiàn)有技術(shù)絕對(duì)預(yù)料不到的。實(shí)施例12(參照?qǐng)D9):一窄亞組的Mxl發(fā)動(dòng)蛋白的N末端區(qū)段包含獨(dú)特的TRAF2/TRAF6結(jié)合基序所有可獲得的Mx序列的仔細(xì)的計(jì)算機(jī)檢查導(dǎo)致在牛、綿羊和印度水牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白的N末端區(qū)中插入的獨(dú)特的六肽“PEEESE”(Pro-Glu-Glu-Glu-Ser-Glu;SEQIDNO:9)的發(fā)現(xiàn)。該基序不存在于迄今已測(cè)序的所有其它Mx發(fā)動(dòng)蛋白中。由于該反芻動(dòng)物特異性六肽同時(shí)具有共有TRAF2結(jié)合基序pX(Q/E)E(SEQIDNO:2)和共有TRAF6結(jié)合基序pXEXX(Ar/Ac)(SEQIDNO:12)，因此其在理論上可用作TRAF2和TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如果可在體內(nèi)確認(rèn)該計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，則該六肽可賦予牛、綿羊和水牛Mxl一方面干擾連接TNF受體、白細(xì)胞介素-I受體(IL-IR)和Toll-樣受體(TLR)超家族的轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，以及另一方面干擾存活/死亡途徑和轉(zhuǎn)錄因子核因子-KB(NF-kB)和激活物蛋白-I(AP-I)的激活的能力。TNF受體(TNFR)超家族由超過(guò)20個(gè)I型跨膜蛋白組成，所述跨膜蛋白被相應(yīng)的TNF-樣配體超家族特異性激活。TNFR的下游離細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑是一組稱為TNFR相關(guān)因子(TRAF)的蛋白質(zhì)。在后者當(dāng)中，TRAF1、2、3和5識(shí)別TNFR并且通過(guò)不與TRAF6的基序重疊的保守序列基序與TNFR締合(圖9a)。從TNFR激活的存活和死亡途徑的TRAF2依賴性調(diào)節(jié)包括許多分子級(jí)聯(lián)，其中有細(xì)胞凋亡的細(xì)胞抑制劑(cIAP)、FLICE-抑制蛋白(FLIPs)和c-JunN末端激酶(JNK)。TRAF6是參與TNF受體超家族和IL-1R/TLR超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的唯一TRAF家族成員。IL-1R/TLR超家族的TRAF6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括一組在TRAF6上游的適體激酶，即IRAKI、IRAK2、IRAKM，其全都包含幾個(gè)潛在的TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖9b)。TRAF6還與TNFR家族成員RANK和⑶40以及與激酶RIP2直接相互作用，這可激活NF_kB，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，TRAF2和TRAF6結(jié)合位點(diǎn)在前述小亞組Mx蛋白的N末端區(qū)段中的存在暗示著這類蛋白質(zhì)可在介導(dǎo)一系列細(xì)胞過(guò)程(所述過(guò)程在存在任何其它Mx蛋白的情況下保持不變)中起著重要作用。實(shí)施例13(參照?qǐng)D10):牛MxI發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合TRAF2，然而PEEESE-缺陷Mx發(fā)動(dòng)蛋白不結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)和免疫沉淀一將野生型、表達(dá)huMxA的VA8、表達(dá)poMxl的VSK6和表達(dá)boMxl的V103細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)充有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM中直至半?yún)R合，隨后將其與媒介物或多西環(huán)素(lyg/mL)接觸,進(jìn)行24小時(shí)。為了進(jìn)行免疫沉淀，隨后將細(xì)胞在4°C于改性RIPA緩沖液(包含O.5%(體積/體積)NP-40,0.1%(重量/體積)脫氧膽酸鈉并且無(wú)SDS)中勻漿30分鐘。在所有裂解物中都包含蛋白酶抑制劑混合物。為了進(jìn)行·TRAF2的內(nèi)源免疫沉淀，將5XIO7個(gè)細(xì)胞與抗_TRAF2mAb—起溫育4小時(shí)，然后用10μI蛋白G珠粒處理另外I小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE分離免疫沉淀的復(fù)合物，用多克隆兔抗-huMxA和抗-boMxl抗血清的混合物來(lái)進(jìn)行印跡。用綴合有HRP的豬抗-兔IgGF(ah')2片段顯示免疫復(fù)合物，用CN/DABSubstrate試劑盒檢測(cè)過(guò)氧化物酶。可重現(xiàn)性地從誘導(dǎo)的V103細(xì)胞，但未從誘導(dǎo)的表達(dá)人MxA(VA8)、豬Mxl(VSK6)或黑長(zhǎng)尾猴Mx的(野生型Vero細(xì)胞)Vero細(xì)胞系回收到與boMxl—致的具有75kDa表觀分子量的條帶(圖10)，這顯示TRAF2有效地結(jié)合boMxl但不結(jié)合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。因此在一小亞組Mx蛋白中插入的獨(dú)特TRAF2和TRAF6結(jié)合基序PEEESE能夠在體內(nèi)結(jié)合TRAF2，這產(chǎn)生了此類Mx蛋白與內(nèi)源TRAF2分子的相互作用可在改變被感染性病毒破壞的細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用的可能性。實(shí)施例14(參照?qǐng)D11):牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白結(jié)合TRAF6，然而PEEESE缺陷Mx發(fā)動(dòng)蛋白不結(jié)合產(chǎn)生具有抑制TRAF2和TRAF6結(jié)合基序的兩個(gè)單點(diǎn)突變(E356D和S358N)的boMxl發(fā)動(dòng)蛋白DNA構(gòu)建體。如先前對(duì)于表達(dá)Mx的克隆VA8、VSK6和V103的產(chǎn)生所描述的，產(chǎn)生當(dāng)與多西環(huán)素接觸時(shí)穩(wěn)定地表達(dá)該構(gòu)建體的VeiO細(xì)胞克隆(V103mut)。將表達(dá)黑長(zhǎng)尾猴Μχ、表達(dá)人MxA的VA8、表達(dá)豬Mxl的、表達(dá)牛Mxl的V103以及表達(dá)新的前述PEEESE缺陷突變型boMxl的V103mutVeix)細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)充有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM中直至半?yún)R合，隨后將其與媒介物或IFNa或多西環(huán)素(Iμg/mL)接觸，進(jìn)行24小時(shí)。之后，除對(duì)于免疫沉淀用抗_TRAF6mAb替代抗_TRAF2mAb外，如實(shí)施例12中所述處理細(xì)胞。可重現(xiàn)性地從誘導(dǎo)的表達(dá)boMxl的細(xì)胞(克隆V103)，但未從誘導(dǎo)的表達(dá)人MxA(克隆VA8)、豬Mxl(克隆VSK6)、黑長(zhǎng)尾猴Mx的(野生型Vero細(xì)胞)或表達(dá)PEEESE缺陷牛Mxl(克隆V103mut)的Vero細(xì)胞系回收到與boMxl—致的具有75kDa表觀分子量的條帶(圖11)，這顯示TRAF6有效地結(jié)合boMxl但不結(jié)合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。因此在一小亞組Mx蛋白中插入的獨(dú)特TRAF2和TRAF6結(jié)合基序PEEESE能夠在體內(nèi)結(jié)合TRAF6，這產(chǎn)生了此類Mx蛋白與內(nèi)源TRAF6分子的相互作用可在改變被感染性病毒破壞的細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用的可能性。實(shí)施例15(參照?qǐng)D12):缺乏其天然TRAF2/TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變型牛Mxl發(fā)動(dòng)蛋白在用甲型流感病毒H5N1株感染的Vero細(xì)胞中顯示出顯著減小的抗甲型流感病毒活性在本實(shí)施例中，由野生型智人和牛Mxl同種型的表達(dá)或由TRAF2和TRAF6結(jié)合位點(diǎn)缺陷型牛Mxl的表達(dá)賦予的對(duì)甲型流感病毒復(fù)制的抗性的程度，通過(guò)測(cè)量由不表達(dá)或表達(dá)所述Mxl同種型的VeiO細(xì)胞單層產(chǎn)生的48小時(shí)的甲型流感病毒產(chǎn)量來(lái)確定。用于該組實(shí)驗(yàn)的Vero細(xì)胞克隆是前述細(xì)胞克隆，即克隆VA8(對(duì)于人Mxl)、克隆V103(對(duì)于牛Mxl)和克隆V103mut(對(duì)于突變型(PEEESE缺陷)boMxl)。在本研究中使用高致病性禽H5N1甲型流感病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)。繁殖病毒，將原液在胚化期雞蛋中生長(zhǎng)，利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法測(cè)定其滴度。為了進(jìn)行感染，首先將原液等分試樣在補(bǔ)充有O.2%BSA的DMEM中稀釋。即時(shí)制備系列稀釋物以產(chǎn)生具有適當(dāng)感染復(fù)數(shù)的體積匹配的接種物，將其摻入誘導(dǎo)的(多西環(huán)素)或非誘導(dǎo)的(媒介物)￥103、￥103-和￥八8細(xì)胞單層，靶感染復(fù)數(shù)為O.I和·I。感染后，使接種物在37°C吸附60分鐘，然后通過(guò)用PBS充分洗滌將其除去。隨后將培養(yǎng)物在37°C于不含多西環(huán)素的DMEM中進(jìn)行溫育。在于37°C溫育48小時(shí)后,對(duì)培養(yǎng)物上清液進(jìn)行取樣，按一式三份利用標(biāo)準(zhǔn)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測(cè)定法在雞成纖維細(xì)胞上測(cè)定病毒滴度。利用Reed-Muench法計(jì)算所有滴度。在其中實(shí)驗(yàn)條件被嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化的本實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，由3種Mx同種型帶來(lái)的抗流感活性明顯不同(圖12)。野生型牛Mxl的表達(dá)對(duì)甲型流感病毒復(fù)制的抑制為突變型TRAF2和TRAF6結(jié)合位點(diǎn)缺陷牛Mxl的表達(dá)或野生型人MxA的表達(dá)對(duì)甲型流感病毒復(fù)制的抑制的約10000倍。因此TRAF2和TRAF6結(jié)合位點(diǎn)可用作GED依賴性抗流感活性的強(qiáng)增強(qiáng)子，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員不能預(yù)測(cè)的。權(quán)利要求1.用于預(yù)防性和/或治療性治療哺乳動(dòng)物的甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Mx蛋白的基因。2.權(quán)利要求I的多核苷酸，其中除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由Mxl蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。3.權(quán)利要求I的多核苷酸，其中除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列由人Mxl(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。4.權(quán)利要求I至3的任一項(xiàng)的多核苷酸，用于預(yù)防性和/或治療性治療人類中由甲型流感病毒誘發(fā)的疾病。5.權(quán)利要求I至4的任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D代表。6.權(quán)利要求I至5的任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D代表并且TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W代表。7.權(quán)利要求I至6的任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由P-X-E-X-X-E,優(yōu)選由P-X-E-E-X-E，更優(yōu)選由P-E-E-E-X-E以及最優(yōu)選由P-E-E-E-S-E代表。8.權(quán)利要求I至7的任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列SEQIDNOs26-77之任一項(xiàng)代表。9.權(quán)利要求I至8的任一項(xiàng)的多核苷酸，其編碼圖15中顯示的氨基酸序列(SEQIDNO17)。10.用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有6至50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D的肽。11.權(quán)利要求10的多核苷酸，其中所述序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。12.權(quán)利要求10或11的多核苷酸，其中所述序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，優(yōu)選是P-X-E-E-X-E，更優(yōu)選是P-E-E-E-X-E以及最優(yōu)選是P-E-E-E-S-E。13.用于基因治療的載體，包含權(quán)利要求I至12的任一項(xiàng)中定義的多核苷酸。14.由權(quán)利要求I至12的任一項(xiàng)中定義的多核苷酸編碼的多肽或肽，其用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病。15.具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包含權(quán)利要求10至12的任一項(xiàng)中定義的多核苷酸作為表達(dá)的轉(zhuǎn)基因。16.具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；條件是該動(dòng)物不屬于靈長(zhǎng)目、?？?牛屬、印度水牛、Ovis)、鰭腳目或嚙齒目的分類組。17.用于產(chǎn)生具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，包括步驟弓I入編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或?qū)RAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域引入編碼Mx蛋白的內(nèi)源基因；其中所得的動(dòng)物表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；條件是所述動(dòng)物不屬于靈長(zhǎng)目、?？?牛屬、印度水牛、Ovis)、鰭腳目或嚙齒目的分類組。18.權(quán)利要求16或17的動(dòng)物或方法，其中編碼所述Mx蛋白的基因是內(nèi)源Mx基因或引入的轉(zhuǎn)基因。19.權(quán)利要求16至18的任一項(xiàng)中的動(dòng)物或方法，其中所述動(dòng)物選自原雞屬(雞)、火雞屬(火雞)、鴨科(鴨、鵝)、豬屬(豬)、馬屬(馬)和斑鱒屬(鮭魚)。20.權(quán)利要求16至19的任一項(xiàng)中的動(dòng)物或方法，其中所述TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，優(yōu)選P-X-Q/E-X-X-E/D代表。21.權(quán)利要求16至20的任一項(xiàng)中的動(dòng)物或方法，其中所述TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D代表并且TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W代表。22.權(quán)利要求16至21的任一項(xiàng)中的動(dòng)物或方法，其中所述TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由P-X-E-X-X-E，優(yōu)選由P-X-E-E-X-E，更優(yōu)選由P-E-E-E-X-E以及最優(yōu)選由P-E-E-E-S-E代表。23.權(quán)利要求16至22的任一項(xiàng)中的動(dòng)物或方法，其中所述TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域由序列SEQIDNOs26-77之任一項(xiàng)代表。24.權(quán)利要求16至23的任一項(xiàng)的動(dòng)物或方法，其中除TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的Mx蛋白序列不是牛Mxl蛋白，并且優(yōu)選與牛Mxl蛋白具有低于95%的同一'丨生,更優(yōu)選具有低于90%的同一性。25.將非肽測(cè)試化合物鑒定為用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的候選化合物的方法，包括在所述測(cè)試化合物存在或不存在的情況下檢查TRAF2和/或TRAF6對(duì)權(quán)利要求13中定義的多肽或肽的結(jié)合的步驟，其中在所述測(cè)試化合物存在的情況下減少的結(jié)合表示所述測(cè)試化合物能夠抑制甲型流感病毒的生命周期，從而適合作為用于預(yù)防性和/或治療性治療甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的候選化合物。全文摘要本發(fā)明涉及用于預(yù)防性和/或治療性治療哺乳動(dòng)物的甲型流感病毒誘發(fā)的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Mx蛋白的基因。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其具有減弱的對(duì)甲型流感病毒的易感性，表達(dá)編碼Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6結(jié)合結(jié)構(gòu)域；條件是所述動(dòng)物不屬于靈長(zhǎng)目、?？?牛屬、印度水牛、Ovis)、鰭腳目或嚙齒目的分類組。文檔編號(hào)C07K14/47GK102892778SQ201080064104公開日2013年1月23日申請(qǐng)日期2010年2月19日優(yōu)先權(quán)日2010年2月19日發(fā)明者D·德斯梅克特,A·M·L·G·考納特申請(qǐng)人:列日大學(xué)