本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甘草為豆科甘草屬植物，是傳統(tǒng)的中草藥，其藥用部位為干燥的根及根莖。三萜類化合物甘草酸是甘草中的主要藥效成分，是目前甘草方向的研究重點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其的深入研究表明，甘草酸(Glycyrrhizin,GL)具有一定的抗炎、保肝、抗病毒、抗過敏、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、解毒等方面的作用。

單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)，由一分子葡萄糖醛酸和一分子的甘草次酸通過糖苷鍵連接而成。其化學(xué)式為C₃₆H₅₄O₁₀，分子量為648.8g mol^-1，根據(jù)其H的平面的不同，包括18β-GAMG和18α-GAMG兩種同分異構(gòu)體。GAMG只含有一個(gè)葡萄糖醛酸基，其極性介于甘草酸和甘草次酸之間，能順利進(jìn)入細(xì)胞，并且親脂性不太強(qiáng)，在機(jī)體內(nèi)的溶解度和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力比甘草酸和甘草次酸強(qiáng)。因而有更好的生物利用度，也能比甘草酸和甘草次酸更好的發(fā)揮藥效。單葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)作為甘草酸的衍生物，兩者具有相似的生物活性，其在抗肝炎、抗過敏、抗癌癥、抗病毒方面的療效顯著高于GL。因此，開發(fā)GAMG作為抗肝炎類、抗過敏、抗癌癥方面的高效新藥具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。GAMG的LD₅₀＝5000mg/kg，GL的LD₅₀＝805mg/kg，因此其比甘草酸更安全，GAMG作為一種新型的天然甜味劑，甜度約是甘草酸的5倍，在食品添加劑方面的應(yīng)用前景廣闊。在化妝品方面，GAMG的性質(zhì)較為穩(wěn)定，不僅耐高溫、耐酸和耐壓，而且有較好的乳化性和起泡性。

在現(xiàn)有的技術(shù)中，制備GAMG包括化學(xué)法和微生物法。甘草酸為苷元甘草次酸分別通過β-1,2糖苷鍵和β-1,3糖苷鍵和兩個(gè)分子葡萄糖醛酸連接而成的，這兩個(gè)糖苷鍵的鍵能是相似的，化學(xué)水解法對(duì)這兩個(gè)糖苷鍵的選擇性很低，采用高能耗和高污染的化學(xué)法制備該產(chǎn)物GAMG時(shí)，也會(huì)生成大量的副產(chǎn)物甘草次酸。因此，化學(xué)法制備生產(chǎn)GAMG的研究較為困難和少見。微生物制備單葡萄糖醛酸甘草次酸，其實(shí)質(zhì)是微生物通過產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶將甘草酸為底物，選擇性斷裂兩個(gè)糖基之間的β-1,2糖苷鍵，從而制得單葡萄糖醛酸甘草次酸。微生物發(fā)酵法存在目的產(chǎn)物產(chǎn)量低，副產(chǎn)物多的缺陷，使發(fā)酵不能滿足國(guó)內(nèi)的工業(yè)化生產(chǎn)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，是將籃狀真菌(Talaromyces sp)按體積以5～10％的接種量接種至以甘草酸作為碳源和誘導(dǎo)劑、硝酸鈉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃發(fā)酵120-144h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述硝酸鈉濃度為2-4g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述硝酸鈉濃度為3g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，控制發(fā)酵過程中甘草酸濃度為1-8g/L進(jìn)行誘導(dǎo)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述甘草酸濃度為5g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述接種是接種種子液，所述種子液是將籃狀真菌接種至種子培養(yǎng)基中，于25～40℃培養(yǎng)36-48h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述種子培養(yǎng)基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.4g。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每L含有：甘草酸1-8g，硝酸鈉2-4g，磷酸二氫鉀1-3g，硫酸鎂0.5-2g，硫酸亞鐵0.01-0.05g。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每L含有：甘草酸5g，硝酸鈉3g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，硫酸亞鐵0.01g。

有益效果：本發(fā)明提供了以甘草酸為碳源，誘導(dǎo)籃狀真菌(Talaromyces sp)生產(chǎn)單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，可以在對(duì)環(huán)境友好的前提下，大量制備具有廣泛研究?jī)r(jià)值的產(chǎn)物GAMG，同時(shí)，該微生物發(fā)酵方法為制備這一三萜類化合物的規(guī)?；a(chǎn)奠定了新的基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，GAMG產(chǎn)量達(dá)到4.05g/L,產(chǎn)率為88.00％，經(jīng)大孔樹脂純化后，其純度達(dá)到80％以上，產(chǎn)物純度高，不發(fā)生結(jié)構(gòu)異化，并具有生產(chǎn)周期短、易于操作、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，適合于后期的工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為按照本發(fā)明的方法進(jìn)行發(fā)酵后發(fā)酵液的液相色譜圖；

圖2為按照對(duì)照例的方法進(jìn)行發(fā)酵后的發(fā)酵液液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

GAMG測(cè)定方法：測(cè)定方法參見《單葡萄糖醛酸甘草次酸分離純化的研究》，作者戴燕，公開于2006年。

實(shí)施例1

種子培養(yǎng)基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.4g。

發(fā)酵培養(yǎng)基每L含有：甘草酸5g，硝酸鈉3g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，硫酸亞鐵0.01g。

將籃狀真菌(Talaromyces sp)接種至種子培養(yǎng)基中，于25～40℃培養(yǎng)36-48h。按體積以5～10％的接種量轉(zhuǎn)接至以硝酸鈉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃發(fā)酵120-144h，發(fā)酵過程中控制終濃度5g/L甘草酸作為碳源和誘導(dǎo)劑。

檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、純度、轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖1所示，保留時(shí)間為16.91的產(chǎn)物GAMG產(chǎn)量達(dá)到4.05g/L,產(chǎn)率為88.00％，且無(wú)保留時(shí)間為24.40的甘草次酸的這一副產(chǎn)物生成，經(jīng)大孔樹脂純化后，其純度達(dá)到80％以上。

對(duì)照例1

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，發(fā)酵過程中不添加甘草酸誘導(dǎo)。對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，GAMG產(chǎn)量接近于0。

對(duì)照例2

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，發(fā)酵培養(yǎng)基中只含有5g/L的甘草酸，不加入其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，未檢測(cè)到GAMG，該菌株幾乎沒有利用甘草酸。

對(duì)照例3

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于,發(fā)酵培養(yǎng)基中分別含有5g/L的葡萄糖和甘草酸、或分別含有5g/L的蔗糖和甘草酸，其產(chǎn)率基本上接近于0。

對(duì)照例4

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，甘草酸濃度為1g/L，其GAMG的產(chǎn)率為42.55％(圖2所示)。

對(duì)照例5

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，分別將氮源替換為3g/L的牛肉膏、尿素、酵母粉，對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，GAMG產(chǎn)率分別為25.87％、24.60％、40.28％。

對(duì)照例6

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，初始pH分別3.5和4.0，對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，GAMG產(chǎn)率分別為23.20％、34.70％。

對(duì)照例7

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，溫度分別為20℃、24℃時(shí)，對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，GAMG產(chǎn)率分別為11.50％、14.86％。

對(duì)照例8

實(shí)施方式同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將籃狀真菌替換為黑曲霉，對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，GAMG產(chǎn)率為51％。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。