本發(fā)明提供一種表達(dá)人或嵌合(例如，人源化)trbc蛋白的非人動(dòng)物及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、傳統(tǒng)的藥物研發(fā)通常使用體外篩選方法，然而這些篩選方法無(wú)法提供機(jī)體環(huán)境(如腫瘤微環(huán)境、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)成分和免疫細(xì)胞相互作用等)，導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)失敗率較高。此外，鑒于人與動(dòng)物之間的差異，使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)藥理試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)結(jié)果可能無(wú)法反映真實(shí)的疾病狀態(tài)和靶向部位的相互作用，導(dǎo)致許多臨床試驗(yàn)的結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在顯著差異。

2、因此，開(kāi)發(fā)適合人用藥物篩選和評(píng)價(jià)的人源化動(dòng)物模型將顯著提高新藥開(kāi)發(fā)效率，降低藥物研發(fā)成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供一種具有人或嵌合trbc蛋白的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型可以表達(dá)人或嵌合trbc(如，人源化trbc)蛋白。它可用于trbc基因功能的研究，還可用于trbc信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑(例如，靶向trbc的治療劑，包括靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)的篩選和評(píng)估。此外，通過(guò)本技術(shù)所述方法制備的動(dòng)物模型可用于藥物篩選、藥效學(xué)研究以及人trbc靶點(diǎn)的疾病(包括腫瘤、炎癥或免疫疾病，優(yōu)選為腫瘤)的治療研究；該動(dòng)物模型還可以用于促進(jìn)新藥開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)，節(jié)省時(shí)間和成本。綜上所述，本發(fā)明為研究trbc蛋白的功能提供了強(qiáng)有力的工具，為篩選相關(guān)疾病治療藥物提供了平臺(tái)。

2、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含至少一條染色體，所述染色體包含編碼人或嵌合t細(xì)胞受體β鏈恒定區(qū)(trbc)蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體包含編碼人或嵌合trbc1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc1蛋白包含人trbc1蛋白胞外區(qū)的全部或部分，優(yōu)選還包含人trbc1蛋白跨膜區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合trbc1蛋白的全部或部分的核苷酸序列可以為基因組dna序列、cds序列或cdna序列。在一些實(shí)施例中，所述的嵌合trbc1蛋白為人源化trbc1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述的嵌合trbc1蛋白包含人或人源化的胞外區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述的嵌合trbc1蛋白包含人或人源化胞外區(qū)、非人動(dòng)物內(nèi)源或人源化跨膜區(qū)、非人動(dòng)物內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc1蛋白的氨基酸序列包含與人trbc1蛋白至少50個(gè)至176個(gè)，例如至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、145、147、149、150、160、163、170、175或176個(gè)連續(xù)或非連續(xù)氨基酸序列一致的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：2、seq?id?no：2的第3-149位、seq?id?no：2的第1-149位或seq?id?no：2的第1-163位；或包含與seq?id?no：2、seq?id?no：2的第3-149位、seq?id?no：2的第1-149位或seq?id?no：2的第1-163位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：1、seq?idno：1的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：1的第146-172位或seq?id?no：1的第160-172位；或包含與seq?id?no：1、seq?id?no：1的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：1的第146-172位或seq?id?no：1的第160-172位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：24，或包含與seq?id?no：24同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體還包含編碼人或嵌合trbc2蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc2蛋白包含人trbc2蛋白胞外區(qū)的全部或部分，優(yōu)選還包含人trbc2蛋白跨膜區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合trbc2蛋白的全部或部分的核苷酸序列可以為基因組dna序列、cds序列或cdna序列。在一些實(shí)施例中，所述的嵌合trbc2蛋白為人源化trbc2蛋白。在一些實(shí)施例中，所述的嵌合trbc1蛋白包含人或人源化胞外區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述的嵌合trbc2蛋白包含人或人源化胞外區(qū)、非人動(dòng)物內(nèi)源或人源化跨膜區(qū)、非人動(dòng)物內(nèi)源胞質(zhì)區(qū)。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc2蛋白的氨基酸序列包含與人trbc2蛋白至少50個(gè)至178個(gè)，例如至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、142、144、147、149、150、160、163、170、175或178個(gè)連續(xù)或非連續(xù)氨基酸序列一致的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc2蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：4、seq?id?no：4的第3-144位、seq?id?no：4的第1-149位或seq?id?no：4的第1-163位；或包含與seq?id?no：4、seq?id?no：4的第3-144位、seq?id?no：4的第1-149位或seqid?no：4的第1-163位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc2蛋白的氨基酸序列包含seqid?no：3、seq?id?no：3的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：3的第146-172位或seq?idno：3的第160-172位；或包含與seq?id?no：3、seq?id?no：3的第1-2位和第146-172位、seqid?no：3的第146-172位或seq?id?no：3的第160-172位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc2蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：25，或包含與seq?id?no：25同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述染色體中包含編碼人或嵌合trbc1蛋白的核苷酸序列，和/或，編碼人或嵌合trbc2蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人或嵌合trbc蛋白包含人或嵌合trbc1蛋白，和/或，人或嵌合trbc2蛋白。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合trbc蛋白的核苷酸序列通過(guò)內(nèi)源調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)進(jìn)行調(diào)控。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，如猴子或嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述的嚙齒動(dòng)物包括小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是小鼠。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)人或嵌合trbc蛋白。

3、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的基因組包含在內(nèi)源trbc基因座處內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列被包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源trbc基因的調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表達(dá)人或人源化trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分，優(yōu)選的，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分和人trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分，和/或，人trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc2基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)，且包含人trbc2基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含與seq?id?no：7所示核苷酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述編碼內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物基因組中修飾的trbc基因?qū)τ趦?nèi)源被替換的基因座為純合或雜合。

4、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座處，用包含人或嵌合trbc的核苷酸序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含編碼人或嵌合trbc1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含編碼人trbc1蛋白胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼人trbc1蛋白跨膜區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含與人trbc1基因至少50到至少1448bp，例如至少50、100、200、300、400、441、500、760、1000、1400、1440、1445或1448bp連續(xù)或非連續(xù)核苷酸一致的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，人trbc1基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5-387bp，例如至少5、10、50、100、150、200、250、300、350、379、380、385或387bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列；人trbc1基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5-107bp，例如至少5、10、15、20、25、30、35、40、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含編碼人或嵌合trbc2蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含編碼人trbc2蛋白胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼人trbc2蛋白跨膜區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含人trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含與人trbc2基因至少50到至少1489bp，例如至少50、100、200、300、400、441、500、700、758、760、1000、1400、1440、1480或1489bp連續(xù)或非連續(xù)核苷酸一致的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，人trbc2基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5-387bp，例如至少5、50、100、150、200、250、300、350、370、379、380、385或387bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列；人trbc2基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5-107bp，例如至少5、10、15、20、25、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的變體包括第142801129位由g突變?yōu)閍、第142802045位由t突變?yōu)閏和第142802078位由a突變?yōu)間。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子3的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分，其中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子3的部分優(yōu)選包含至少1-375bp，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、350或375bp連續(xù)核苷酸序列，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5-107bp，例如至少5、10、20、30、40、50、60、61、62、63、64、65、70、80、90、100或107bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至外顯子4的全部，其中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5-107bp，例如5、10、20、30、40、50、60、61、62、63、64、65、70、80、90、100或107bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至終止密碼子的核苷酸序列，優(yōu)選還包含3’utr，進(jìn)一步優(yōu)選還包含3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位核苷酸序列；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列從5’端至3’端依次包含人trb1基因外顯子1的部分至外顯子3的部分、非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子3的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分、人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，以及非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含seq?id?no：7；或包含與seq?id?no：7所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白跨膜區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼seq?id?no：1的第1-145位、seq?id?no：1的第3-145位或seq?id?no：1的第1-159位的核苷酸序列，或包含與編碼seq?id?no：1的第1-145位、seq?id?no：1的第3-145位或seq?id?no：1的第1-159位的核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5-375bp，例如5、50、100、150、200、250、300、350、360、367、370或375bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列；非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5-107bp，例如5、10、15、20、25、30、35、40、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白的全部或部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白跨膜區(qū)的全部或部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含編碼seq?id?no：3的第1-145位、seq?id?no：3的第3-145位或seqid?no：3的第1-159位的核苷酸序列，或包含與編碼seq?id?no：3的第1-145位、seq?id?no：3的第3-145位或seq?id?no：3的第1-159位的核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5-375bp，例如5、50、100、150、200、250、300、350、360、367、370或375bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列；非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5-107bp，例如5、10、15、20、25、30、35、40、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或嵌合trbc蛋白的核苷酸序列，或，包含人或嵌合trbc的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源trbc基因座的內(nèi)源調(diào)控元件。在一些實(shí)施例中，所述的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源trbc蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中trbc相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物基因組中修飾的trbc基因?qū)τ趦?nèi)源被替換的基因座為純合或雜合。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如，猴子或嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述的嚙齒動(dòng)物包括小鼠或大鼠。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中修飾的trbc1基因轉(zhuǎn)錄的mrna包含seq?id?no：26；或包含與seq?id?no：26所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中修飾的trbc2基因轉(zhuǎn)錄的mrna包含seq?id?no：27；或包含與seq?id?no：27所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括編碼其他的人或嵌合蛋白的核苷酸序列，所述其他的人或嵌合蛋白優(yōu)選包括nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。

5、在一方面，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物包含至少一個(gè)編碼人或人源化trbc蛋白的核苷酸序列的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物表達(dá)人或人源化trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白包含人源化trbc1蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白包含人源化trbc2蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白包含人源化trbc1蛋白的全部或部分和人源化trbc2蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc1蛋白與人trbc1蛋白的連續(xù)氨基酸序列至少50個(gè)至176個(gè)，例如至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、145、147、149、150、160、163、170、175或176個(gè)連續(xù)氨基酸一致。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2蛋白與人trbc2蛋白的連續(xù)氨基酸序列至少50個(gè)至178個(gè)，例如至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、142、144、147、149、150、160、163、170、175或178個(gè)連續(xù)氨基酸一致。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或人源化trbc蛋白的核苷酸序列通過(guò)內(nèi)源調(diào)控元件進(jìn)行調(diào)控。在一些實(shí)施例中，所述的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr。在一些實(shí)施例中，所述編碼人或人源化trbc蛋白的核苷酸序列可被整合至所述非人動(dòng)物內(nèi)源基因座。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白具有至少一種活性，例如非人動(dòng)物內(nèi)源trbc活性和/或人trbc活性。

6、在一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物或其構(gòu)建方法，所述非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞中，在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座處，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列被包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物的內(nèi)源trbc蛋白不表達(dá)或與野生型動(dòng)物中trbc相比表達(dá)水平降低。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分，優(yōu)選的，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分和人trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)，優(yōu)選的，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)和人trbc2基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列編碼的氨基酸序列包含與seqid?no：24和/或seq?id?no：25所示氨基酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含與seq?id?no：7所示核苷酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分，優(yōu)選的，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，如，猴子或嚙齒動(dòng)物(小鼠或大鼠)。

7、在一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)人或嵌合trbc的基因修飾非人動(dòng)物細(xì)胞的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座處，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列被包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換，產(chǎn)生基因修飾的非人動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)人或嵌合trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分，優(yōu)選的，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的全部或部分和人trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)，優(yōu)選的，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含人trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)和人trbc2基因的外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列編碼的氨基酸序列包含與seq?idno：24和/或seq?id?no：25所示氨基酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列包含與seq?id?no：7所示核苷酸序列一致或同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分，優(yōu)選的，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的全部或部分和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)，優(yōu)選的，所述非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分、外顯子2的全部和外顯子3的部分(優(yōu)選還包含內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2)。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列可操作地連接至內(nèi)源調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是小鼠。

8、在一方面，提供了一種測(cè)定治療劑治療疾病有效性或毒性的方法，所述方法包括：1)向所述非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑；2)確定治療劑對(duì)非人動(dòng)物或疾病的作用。在一些實(shí)施例中，所述治療劑包括靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述治療劑還包括附加治療劑，所述的附加治療劑優(yōu)選包含抗nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4的抗體中的一種或兩種以上。在一些實(shí)施例中，所述的附加治療劑進(jìn)一步優(yōu)選包括抗pd-1抗體、抗pd-l1抗體或抗ctla4抗體中的一種或兩種以上。在一些實(shí)施例中，所述的疾病包括腫瘤、免疫疾病或炎癥中的一種或兩種以上。在一些實(shí)施例中，所述的疾病為腫瘤。在一些實(shí)施例中，所述的腫瘤包括實(shí)體瘤或血液瘤。在一些實(shí)施例中，所述的腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、女性生殖系統(tǒng)癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴細(xì)胞腫瘤(例如t細(xì)胞腫瘤和/或b細(xì)胞腫瘤)、頭頸癌、肝癌或肺癌中的一種或兩種以上。在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特異性皮炎、銀屑病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥中的一種或兩種以上。在一些實(shí)施例中，所述炎癥包括炎癥性腸病(ibd)。

9、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療癌癥(腫瘤)有效性的方法，所述方法包括：

10、1)向所述非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物具有腫瘤；2)確定治療劑對(duì)腫瘤的抑制作用。在一些實(shí)施例中，所述治療劑包括靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述腫瘤包含一個(gè)或多個(gè)腫瘤細(xì)胞注射到非人動(dòng)物體內(nèi)。在一些實(shí)施例中，所述確定治療劑對(duì)腫瘤的抑制作用涉及測(cè)量非人動(dòng)物中的腫瘤體積。在一些實(shí)施例中，所述癌癥(腫瘤)包括實(shí)體瘤或血液瘤。在一些實(shí)施例中，所述的癌癥(腫瘤)包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、女性生殖系統(tǒng)癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴細(xì)胞腫瘤(例如t細(xì)胞腫瘤和/或b細(xì)胞腫瘤)、頭頸癌、肝癌或肺癌中的一種或兩種以上。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物進(jìn)一步包含編碼人或嵌合pd-1、人或嵌合pd-l1和/或人或嵌合ctla4的序列。在一些實(shí)施例中，所述腫瘤包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)pd-l1的腫瘤細(xì)胞。

11、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療免疫疾病有效性的方法，所述方法包括：1)向所述非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物患有免疫疾?。?)測(cè)定治療劑對(duì)免疫疾病的治療作用。在一些實(shí)施例中，所述治療劑包括靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特異性皮炎、銀屑病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥中的一種或兩種以上。

12、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑治療炎癥有效性的方法，所述方法包括：1)向所述的非人動(dòng)物或所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物具有炎癥；2)測(cè)定治療劑對(duì)治療炎癥的有效性。在一些實(shí)施例中，所述治療劑包括靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述炎癥包括炎癥性腸病(ibd)。

13、在一方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定治療劑毒性的方法，所述方法包括：1)向所述的非人動(dòng)物施用治療劑；2)測(cè)定治療劑對(duì)非人動(dòng)物的作用。在一些實(shí)施例中，所述治療劑包括靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述測(cè)定治療劑對(duì)非人動(dòng)物的作用涉及測(cè)量非人動(dòng)物的體重或進(jìn)行血液檢查。在一些實(shí)施例中，所述的血液檢查包括但不限于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容和/或血紅蛋白含量。

14、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化trbc蛋白，所述人源化trbc蛋白包含人trbc1蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白包含人trbc1蛋白胞外區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc蛋白包含人源化trbc1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：24，或包含與seq?id?no：24所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白包含人trbc2蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白包含人trbc2蛋白胞外區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc蛋白包含人源化trbc2蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：25，或包含與seq?id?no：25所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。

15、在一方面，提供了一種人源化trbc1蛋白，所述人源化trbc1蛋白包含人trbc1蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc1蛋白包含人trbc1蛋白的胞外區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc1蛋白包含seq?id?no：2、seq?id?no：2的第3-149位、seq?id?no：2的第1-149位或seq?id?no：2的第1-163位所示氨基酸序列；或包含與seq?id?no：2、seq?id?no：2的第3-149位、seq?id?no：2的第1-149位或seq?id?no：2的第1-163位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc1蛋白還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc1蛋白包含seq?id?no：1、seq?id?no：1的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：1的第146-172位或seq?id?no：1的第160-172位；或包含與seq?id?no：1、seq?id?no：1的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：1的第146-172位或seqid?no：1的第160-172位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc1蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：24，或包含與seq?id?no：24所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。

16、在一方面，提供了一種人源化trbc2蛋白，所述人源化trbc2蛋白包含人trbc2蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc2蛋白包含人trbc2蛋白的胞外區(qū)的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc2蛋白包含seq?id?no：4、seq?id?no：4的第3-144位、seq?id?no：4的第1-149位或seq?id?no：4的第1-163位所示氨基酸序列；或包含與seq?id?no：4、seq?id?no：4的第3-144位、seq?id?no：4的第1-149位或seq?id?no：4的第1-163位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc2蛋白還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2蛋白包含seq?id?no：3、seq?id?no：3的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：3的第146-172位或seq?id?no：3的第160-172位；或包含與seq?id?no：3、seq?id?no：3的第1-2位和第146-172位、seq?id?no：3的第146-172位或seqid?no：3的第160-172位所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no：25，或包含與seq?id?no：25所示氨基酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的氨基酸序列。

17、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化trbc基因，所述人源化trbc基因編碼所述人源化trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc基因包含人trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，人trbc1基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列；人trbc1基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc基因包含人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，人trbc2基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列；人trbc2基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述包含人或嵌合trbc的核苷酸序列包含ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的變體包括第142801129位由g突變?yōu)閍、第142802045位由t突變?yōu)閏和第142802078位由a突變?yōu)間。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbd2基因和/或trbj基因(優(yōu)選包含trbj2-1、trbj2-2、trbj2-3、trbj2-4、trbj2-5、trbj2-6和trbj2-7基因)。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子3的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含ncbi登錄號(hào)為ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至外顯子4的全部。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至終止密碼子的核苷酸序列，優(yōu)選還包含3’utr，進(jìn)一步優(yōu)選還包含3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的包含人或嵌合trbc的核苷酸序列還包含ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位核苷酸序列；或包含與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc基因從5’端至3’端依次包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子1的部分、人trbc1基因外顯子1的部分至外顯子3的部分、非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子3的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分、人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，以及非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc基因包含seq?id?no：5、6、

18、7、8、9、10、11、26、27、28、29、30、ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列、ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列、ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體、或ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位所示核苷酸序列；或包含與seq?id?no：5、6、7、8、9、10、11、26、27、28、29、30、ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列、ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列、ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體、或ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的變體包括第142801129位由g突變?yōu)閍、第142802045位由t突變?yōu)閏和第142802078位由a突變?yōu)間。

19、在一方面，本發(fā)明提供了一種人源化trbc1基因，所述人源化trbc1基因編碼所述人源化trbc1蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc1基因包含人trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，人trbc1基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列；人trbc1基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc1基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子3的部分至外顯子4的全部。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc1基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分、外顯子3的部分至終止密碼子的核苷酸序列，優(yōu)選還包含3’utr，進(jìn)一步優(yōu)選還包含3’utr下游核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc1基因轉(zhuǎn)錄的mrna包含seqid?no：26所示核苷酸序列；或包含與seq?id?no：26所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

20、在一方面，提供了人源化trbc2基因，所述人源化trbc2基因編碼所述人源化trbc2蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2基因包含人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，其中，人trbc2基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列；人trbc2基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分、外顯子3的部分至外顯子4的全部。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc2基因還包含非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分、外顯子3的部分至終止密碼子的核苷酸序列，優(yōu)選還包含3’utr，進(jìn)一步優(yōu)選還包含3’utr下游核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列；非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的外顯子3的部分優(yōu)選包含至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc2基因轉(zhuǎn)錄的mrna包含seq?id?no：27所示核苷酸序列；或包含與seq?id?no：27所示核苷酸序列同一性至少為70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的核苷酸序列。

21、在一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞、組織或器官，所述細(xì)胞、組織或器官表達(dá)所述的人源化trbc蛋白、所述的人源化trbc1蛋白和/或所述的人源化trbc2蛋白，和/或，所述細(xì)胞、組織或器官的基因組中包含所述的人源化trbc基因、所述的人源化trbc1基因和/或所述的人源化trbc2基因。

22、在一方面，本發(fā)明提供了一種動(dòng)物模型，所述的動(dòng)物模型表達(dá)所述的人源化trbc蛋白、所述的人源化trbc1蛋白和/或所述的人源化trbc2蛋白，和/或，所述的動(dòng)物模型的基因組中包含所述的人源化trbc基因、所述的人源化trbc1基因和/或所述的人源化trbc2基因。

23、在一方面，部分提供了一種所述的非人動(dòng)物、所述構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物、所述的人源化trbc蛋白、所述的人源化trbc1蛋白、所述的人源化trbc2蛋白、所述的人源化trbc基因、所述的人源化trbc1基因、所述的人源化trbc2基因、所述的細(xì)胞、組織或器官或所述的動(dòng)物模型的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括：a)涉及人類(lèi)細(xì)胞的與trbc相關(guān)的免疫過(guò)程的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用；b)作為藥理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的與trbc相關(guān)的模型系統(tǒng)中的應(yīng)用；c)涉及生產(chǎn)和利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)疾病模型用于與trbc相關(guān)的病原學(xué)研究和/或用于開(kāi)發(fā)診斷策略和/或用于開(kāi)發(fā)治療策略中的應(yīng)用；d)在體內(nèi)研究人trbc信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑的篩選、藥效檢測(cè)、評(píng)估療效、驗(yàn)證或評(píng)價(jià)中的應(yīng)用；或者，e)研究trbc基因功能，研究針對(duì)人trbc靶位點(diǎn)的藥物、藥效，研究與trbc相關(guān)的腫瘤治療藥物方面的應(yīng)用(優(yōu)選還包含研究與trbc相關(guān)的炎癥或免疫疾病的治療藥物方面的應(yīng)用)。

24、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“全部或部分”，“全部”為整體，“部分”為整體中的局部，或者組成整體的部分個(gè)體。

25、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“trbc基因”包括trbc基因的一種或兩種以上的亞型，例如在本技術(shù)中，所述的trbc基因包括trbc1基因，優(yōu)選還包括trbc2基因。

26、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“trbc蛋白”包括trbc蛋白的一種或兩種以上的亞型，例如在本技術(shù)中，所述的trbc蛋白包括trbc1蛋白，優(yōu)選還包含trbc2蛋白。

27、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“基因座”廣義上講代表基因在染色體上所占的位置，狹義上講代表某一基因上的一段dna片段，既可以是一個(gè)基因也可以是一個(gè)基因的一部分或調(diào)控區(qū)域，或者可以包含同一基因簇上的一個(gè)或多個(gè)基因的全部或部分。例如本技術(shù)所述的“trbc基因座”包括trbc1基因外顯子1-4中任選一段的dna片段，還可以包括trbc2基因外顯子1-4中任選一段的dna片段，當(dāng)然也可以包含trbc1基因和trbc2基因之間基因片段，例如trbd2基因的全部或部分，和/或，trbj基因的全部或部分。

28、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外顯子xx的部分”表示連續(xù)或間隔幾個(gè)、幾十個(gè)或幾百個(gè)核苷酸與全部的外顯子核苷酸序列一致或者與外顯子的編碼區(qū)核苷酸序列一致，例如人trbc1基因的外顯子1的部分優(yōu)選包含至少5-387bp，例如5、10、50、100、150、200、250、300、350、379、380、385或387bp連續(xù)核苷酸序列，優(yōu)選包含編碼區(qū)的核苷酸序列。

29、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外顯子xx至外顯子xxx”或“外顯子xx-xxx”或“外顯子xx-xxx的全部”或“外顯子xx的全部至外顯子xxx的全部”，是指包含一個(gè)外顯子至另一個(gè)外顯子及其之間的內(nèi)含子的全部核苷酸序列，例如trbc1基因外顯子1-4包含了外顯子1的全部、內(nèi)含子1的全部、外顯子2的全部、內(nèi)含子2的全部、外顯子3的全部、內(nèi)含子3的全部和外顯子4的全部核苷酸序列。

30、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“外顯子xx的部分至外顯子xxx的部分”，是指一個(gè)外顯子的全部或部分至另一個(gè)外顯子的部分及其之間的內(nèi)含子的核苷酸序列，例如外顯子1的部分至外顯子3的部分包含了外顯子1的部分、內(nèi)含子1的全部、外顯子2的全部、內(nèi)含子2的全部和外顯子3的部分的核苷酸序列。

31、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子xx”是指兩個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子，例如內(nèi)含子1是指外顯子1和外顯子2之間的內(nèi)含子。

32、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“包括”或“包含”為開(kāi)放式寫(xiě)法，含有所描述的指定成分或步驟，以及不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響的其他指定成分或步驟。當(dāng)用于描述蛋白質(zhì)或核酸的序列時(shí)，所述蛋白質(zhì)或核酸可以由所述序列組成，或者在所述蛋白質(zhì)或核酸的一端或兩端可以具有額外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有與原序列相同或相似的活性。

33、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“和/或”包含該術(shù)語(yǔ)所連接的項(xiàng)目的所有組合，應(yīng)視為各個(gè)組合已經(jīng)單獨(dú)地在本技術(shù)中列出，例如“a和/或b”包含了“a”、“b”以及“a和b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。

34、為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較的目的對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)(例如，為了最佳比對(duì)，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或兩個(gè)中引入間隙，并且為了比較的目的可以忽略非同源序列)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械囊粋€(gè)位置被與第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，考慮到間隙的數(shù)量和每個(gè)間隙的長(zhǎng)度，這需要引入以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。例如，序列的比較和兩個(gè)序列之間的同一性百分比的確定可以使用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的blossum?62評(píng)分矩陣來(lái)完成。

35、具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的保守殘基的百分比(同源性百分比)，例如亮氨酸和異亮氨酸，也可用于測(cè)量序列相似性。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有類(lèi)似物理化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)的氨基酸，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨質(zhì)、組氨酸)。在許多情況下，同源性百分比高于同一性百分比。

36、除非另有定義，本技術(shù)使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。本技術(shù)描述了用于本發(fā)明的方法和材料；可以使用本領(lǐng)域已知的其他合適的方法和材料。材料、方法和實(shí)施例僅是示例性的而非限制性的。本技術(shù)提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)條目和其他參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用整體并入。在沖突的情況下,以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。

37、本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從下文的詳細(xì)描述中容易地洞察到本技術(shù)的其它方面和優(yōu)勢(shì)。

38、載體

39、本發(fā)明提供了一種靶向載體，包括：a)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)5’端同源的dna片段(5’臂或5’同源臂)，其選自trbc1基因的基因組dna，長(zhǎng)度為100-10000個(gè)核苷酸；b)供體區(qū)域；和c)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)3’端同源的dna片段(3’臂或3’同源臂)，其選自trbc2基因的基因組dna，長(zhǎng)度為100-10000個(gè)核苷酸。

40、在一些實(shí)施例中，a)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)5’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7至少具有90％同源性的核苷酸序列；c)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)3’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7至少具有90％同源性的核苷酸序列。

41、在一些實(shí)施例中，a)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)5’端同源的dna片段選自ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41511487至41515159位核苷酸序列；c)與待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)3’端同源的dna片段選自與ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41525761至41529797位核苷酸序列。

42、在一些實(shí)施例中，靶向載體所選的基因組核苷酸序列長(zhǎng)度可以超過(guò)0.8kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb、7.5kb、8kb、8.5kb、9kb、9.5kb、10kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb或20kb。

43、在一些實(shí)施例中，所述的待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)位于非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座上，優(yōu)選位于非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1的外顯子1至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2的3’utr下游核苷酸序列上。

44、在一些實(shí)施例中，所述的5’臂包含seq?id?no：5。在一些實(shí)施例中，所述的3’臂包含seq?id?no：6。

45、在一些實(shí)施例中，所述的b)供體區(qū)域包含人序列或人/非人動(dòng)物的嵌合序列。

46、在一些實(shí)施例中，所述的b)供體區(qū)域包含seq?id?no：7。

47、在一些實(shí)施例中，所述的靶向載體包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因(或抗性基因)，例如，陽(yáng)性克隆篩選的抗性基因或負(fù)篩選標(biāo)記的編碼基因。在一些實(shí)施例中，陽(yáng)性克隆篩選的抗性基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶編碼序列neo，優(yōu)選的，所述的靶向載體中還包括標(biāo)記基因兩側(cè)的兩個(gè)同向排列的frt重組位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，負(fù)篩選標(biāo)記的編碼基因?yàn)榘缀矶舅豠亞基的編碼基因(dta)。

48、本發(fā)明還提供了用于構(gòu)建人源化動(dòng)物模型或敲除模型的載體。在一些實(shí)施例中，所述的載體包含sgrna序列，其中sgrna序列靶向trbc基因座。在一些實(shí)施例中，sgrna在待改變的轉(zhuǎn)換區(qū)上的靶位點(diǎn)是唯一的，并且滿(mǎn)足5'-nnn(20)-ngg3'或5'-ccn-n(20)-3'的序列排列規(guī)則。

49、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及包含sgrna的質(zhì)粒構(gòu)建體(sgrna載體，例如pt7-sgrna)和/或包含該構(gòu)建體的細(xì)胞。

50、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及包含如上所述的靶向載體和/或sgrna載體的細(xì)胞。

51、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了一種非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其具有上述載體中的任一種，以及本技術(shù)所述質(zhì)粒構(gòu)建體中的一種或多種體外轉(zhuǎn)錄物。在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中包含cas9?mrna或其體外轉(zhuǎn)錄物。

52、在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因是雜合的。在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因是純合的。

53、在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞是受精卵細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞是任一種能夠表達(dá)trbc1蛋白和/或trbc2蛋白的細(xì)胞。

54、基因修飾的非人動(dòng)物

55、本發(fā)明所述“基因修飾的非人動(dòng)物”或“遺傳修飾的非人動(dòng)物”是指該非人動(dòng)物基因組中至少一條染色體具有外源dna的非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，至少一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，例如，基因修飾的非人動(dòng)物或遺傳修飾的非人動(dòng)物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的細(xì)胞具有外源dna。具有外源dna的細(xì)胞可以是各種細(xì)胞，例如，體細(xì)胞、免疫細(xì)胞(包括t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)、生殖細(xì)胞、囊胚或腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物，所述非人動(dòng)物包含被修飾的內(nèi)源基因座，包含外源序列(如，人源序列)，例如，用人源序列，或者，人源/非人動(dòng)物內(nèi)源的嵌合序列替換一個(gè)或多個(gè)非人動(dòng)物內(nèi)源序列，或插入一個(gè)或多個(gè)人源和/或非人動(dòng)物內(nèi)源的嵌合序列。非人動(dòng)物通常能夠通過(guò)種系傳播將基因修飾傳遞給后代。

56、本發(fā)明所述“嵌合(x)基因”或“嵌合(x)核酸”是指基因或核酸。在一些實(shí)施例中，所述基因或核酸的兩個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自不同物種，或者該基因或核酸的至少一個(gè)序列與野生型動(dòng)物中的核酸不同。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸的至少一部分序列具有兩個(gè)或多個(gè)不同的來(lái)源，例如，編碼不同蛋白的序列或編碼兩個(gè)或多個(gè)不同物種的相同(或同源)蛋白的序列。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)基因或嵌合(x)核酸是指人源化(x)基因或人源化(x)核酸。

57、本發(fā)明所述“嵌合(x)蛋白”或“嵌合(x)多肽”是指蛋白或多肽。在一些實(shí)施例中，所述多肽或蛋白的兩個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自不同物種，或者該蛋白或多肽的至少一個(gè)序列與野生型動(dòng)物中的氨基酸序列不同。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽的至少一部分序列具有兩個(gè)或多個(gè)不同來(lái)源，例如，不同物種的相同(或同源)蛋白。在一些實(shí)施例中，嵌合(x)蛋白或嵌合(x)多肽是指人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽。

58、本發(fā)明所述“人源化(x)蛋白”或“人源化(x)多肽”是指蛋白或多肽。在一些實(shí)施例中，所述蛋白或多肽的至少一部分來(lái)自人(x)蛋白或人(x)多肽。在一些實(shí)施例中，所述蛋白或多肽的至少一部分來(lái)自非人動(dòng)物(x)蛋白或非人動(dòng)物(x)多肽。在一些實(shí)施例中，人源化(x)蛋白或人源化(x)多肽是指人(x)蛋白或(x)多肽。

59、本發(fā)明所述“人源化(x)核酸”“人源化(x)基因”是指核酸或基因。在一些實(shí)施例中，所述核酸或基因的至少一部分來(lái)自人(x)基因或人(x)核酸。在一些實(shí)施例中，所述核酸或基因的至少一部分來(lái)自非人動(dòng)物(x)基因或非人動(dòng)物(x)核酸。在一些實(shí)施例中，人源化(x)核酸或人源化(x)基因中的核酸或基因全部來(lái)源于人(x)基因或人(x)核酸。在一些實(shí)施例中，人源化(x)核酸或人源化(x)基因是指人源化外顯子，所述人源化外顯子可以是人的外顯子或嵌合外顯子。

60、在一些實(shí)施例中，嵌合trbc基因或嵌合trbc核酸是人源化trbc基因或人源化trbc核酸(包括人源化trbc1基因或人源化trbc1核酸，和/或，人源化trbc2基因或人源化trbc2核酸)。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc基因或人源化trbc核酸的至少一部分來(lái)源于人trbc基因。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc基因或人源化trbc核酸的至少一部分來(lái)源于非人動(dòng)物trbc基因。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc基因或人源化trbc核酸包含編碼trbc蛋白的序列。編碼的trbc蛋白至少具有一種活性，例如人trbc蛋白和/或非人動(dòng)物內(nèi)源trbc蛋白的活性。

61、在一些實(shí)施例中，所述嵌合trbc蛋白或嵌合trbc多肽是人源化trbc蛋白或人源化trbc多肽(包括人源化trbc1蛋白或人源化trbc1多肽，和/或，人源化trbc2蛋白或人源化trbc2多肽)。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白或人源化trbc多肽氨基酸序列的至少一個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自人trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，所述人源化trbc蛋白或者人源化trbc多肽的至少一個(gè)或多個(gè)部分來(lái)自非人動(dòng)物trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，人源化trbc蛋白或人源化trbc多肽是功能性的，或至少具有一種活性，例如人trbc蛋白和/或非人動(dòng)物內(nèi)源trbc蛋白的活性。

62、基因修飾的非人動(dòng)物可以是各種非人動(dòng)物，例如，小鼠、大鼠、兔子、豬、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)。對(duì)于不容易獲得合適的可遺傳修飾胚胎干細(xì)胞(es)的非人動(dòng)物，采用其他方法來(lái)構(gòu)建包含遺傳修飾的非人動(dòng)物。這樣的方法包括，例如，修飾非es細(xì)胞基因組(例如，成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)并采用核移植將修飾的基因組轉(zhuǎn)移到合適的細(xì)胞，例如卵母細(xì)胞，以及在適當(dāng)?shù)臈l件下在非人動(dòng)物中孕育修飾的細(xì)胞(例如，修飾的卵母細(xì)胞)以形成胚胎。上述所述構(gòu)建方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且在“a.nagy,et?al.,“manipulating?the?mouse?embryo:alaboratory?manual(third?edition),”cold?spring?harbor?laboratory?press,2006”有所描述，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本技術(shù)。

63、在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物可以選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物選自鼠家族。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的非人動(dòng)物來(lái)自選自麗倉(cāng)鼠科(例如小鼠樣倉(cāng)鼠)、倉(cāng)鼠科(例如倉(cāng)鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠總科(小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、馬島鼠科(登山小鼠、巖小鼠、有尾大鼠、馬達(dá)加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼴形鼠科(例如摩爾大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因修飾的嚙齒動(dòng)物選自小鼠或大鼠(鼠總科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的小鼠來(lái)自鼠科家族成員。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠。

64、在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物可以是免疫缺陷的非人哺乳動(dòng)物。例如免疫缺陷的嚙齒動(dòng)物、免疫缺陷的兔子、免疫缺陷的豬、免疫缺陷的猴子等。在一些實(shí)施例中，所述動(dòng)物是c57bl品系的小鼠，所述c57bl品系選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/10、c57bl10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在一些實(shí)施例中，小鼠是選自129/j、129/rej、129/olahsd、129/sv、129/svj、129/re、129/rrj、129/sv-ter/+的129品系。這些小鼠描述于例如festing?et?al.,revised?nomenclature?for?strain129mice,mammalian?genome?10:836(1999)；auerbach?et?al.,establishment?andchimera?analysis?of?129/svev-and?c57bl/6-derived?mouse?embryonic?stem?celllines(2000)，上述文獻(xiàn)相關(guān)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本技術(shù)。在一些實(shí)施例中，遺傳修飾的小鼠是129品系和c57bl/6品系的雜交。在一些實(shí)施例中，小鼠是129品系的雜交，或c57bl/6品系的雜交。在一些實(shí)施例中，小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在一些實(shí)施例中，小鼠是balb品系和另一品系的雜交。在一些實(shí)施例中，小鼠來(lái)自雜交系(例如，50％balb/c-50％12954/sv；或50％?c57bl/6-50％129)。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物是具有balb/c、balb/chean、balb/cj、balb/crl、balb/cwt、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl(c57bl/10cr和c57bl/ola)、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st或cba/h品系的小鼠在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物是大鼠。大鼠可以選自wistar大鼠、lea品系、sprague-dawley品系、fischer品系、f344、f6和dark?agouti。在一些實(shí)施例中，大鼠品系是選自wistar、lea、sprague-dawley、fischer、f344、f6和dark?agouti的兩種或多種品系的雜交物種。非人動(dòng)物可以具有一個(gè)或多個(gè)其他基因修飾和/或其他修飾，其適合于制備人源化動(dòng)物的特定目的。例如，用于維持異種移植物(例如人類(lèi)癌癥或腫瘤)的合適小鼠可以有一個(gè)或多個(gè)修飾，這些修飾會(huì)損害、滅活或破壞非人動(dòng)物的全部或部分免疫系統(tǒng)。非人動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的損害、失活或破壞可以包括例如通過(guò)化學(xué)手段(例如施用毒素)、物理手段(例如照射動(dòng)物)，和/或基因修飾(例如敲除一個(gè)或多個(gè)基因)。這類(lèi)小鼠的非限制性實(shí)例包括，例如，nod小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠，il2rγ敲除小鼠，nod/scid/γcnull小鼠(ito,m.et?al.,nod/scid/γcnull?mouse:an?excellent?recipient?mouse?model?forengraftment?of?human?cells,blood?100(9):3175-3182,2002)，裸鼠，以及rag1和/或rag2敲除小鼠。這些小鼠可以任選地被照射，或以其他方式被處理以破壞一種或多種免疫細(xì)胞類(lèi)型。因此，在各種實(shí)施例中，提供了一種基因修飾小鼠，其可以包括至少一部分非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座的人源化，并且還包括損害、失活或部分破壞非人動(dòng)物的免疫系統(tǒng)(或免疫系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞類(lèi)型)的修飾。在一些實(shí)施例中，小鼠修飾類(lèi)型選自nod小鼠、scid小鼠、nod/scid小鼠，il-2rγ敲除小鼠、nod/scid/γcnull小鼠、裸鼠、rag1和/或rag2敲除小鼠，nod?prkdcscid?il-2rγnull小鼠、nod?rag1-/-il2rg-/-(nrg)小鼠、rag2-/-il2rg-/-(rg)小鼠及其組合的修飾。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被描述在例如us10820580b2中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本技術(shù)。在一些實(shí)施例中，小鼠可以包括用人成熟trbc1編碼序列的全部或部分和人成熟trbc2編碼序列的全部或部分，替換小鼠內(nèi)源成熟trbc1編碼序列的全部或部分和小鼠內(nèi)源成熟trbc2編碼序列的全部或部分。

65、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物包括非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因位點(diǎn)(基因座)的修飾。在一些實(shí)施例中，所述修飾包含編碼至少一部分成熟trbc1蛋白和/或成熟trbc2蛋白的核苷酸序列(例如，包含與編碼成熟的trbc1蛋白的全部或部分和/或成熟的trbc2蛋白的全部或部分的核苷酸序列一致或同一性至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列)。雖然在本發(fā)明中提供了可包含所述基因修飾的細(xì)胞(例如，es細(xì)胞、體細(xì)胞)。

66、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可以在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座表達(dá)人trbc蛋白和/或嵌合(例如人源化)trbc蛋白。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列被包含人trbc基因的全部或部分的核苷酸序列、編碼人trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列或與人trbc序列同一性至少為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％或99.5％的核苷酸序列取代(替換)或插入。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座被包含編碼人成熟trbc蛋白的全部或部分核酸序列修飾。在一些實(shí)施例中，所述的trbc蛋白包括trbc1蛋白和/或trbc2蛋白。

67、在一些實(shí)施例中，經(jīng)基因修飾的非人動(dòng)物可以在內(nèi)源或外源調(diào)控元件的控制下，表達(dá)人trbc和/或嵌合trbc(例如，人源化trbc)。在非人動(dòng)物內(nèi)源基因座處進(jìn)行插入或替換提供了在合適的細(xì)胞中表達(dá)人trbc和/或嵌合trbc(例如人源化trbc)并且以不導(dǎo)致在本領(lǐng)域已知的一些其它轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的潛在病理的方式的非人動(dòng)物。在非人動(dòng)物中表達(dá)的人trbc或嵌合trbc(例如人源化trbc)可以在非人動(dòng)物中維持野生型非人動(dòng)物trbc或人trbc的一種或多種功能。此外，在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物不表達(dá)內(nèi)源trbc。在一些實(shí)施例中，與野生型非人動(dòng)物中的trbc表達(dá)水平相比，非人動(dòng)物內(nèi)源trbc表達(dá)水平降低。本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源trbc”是指在任何基因修飾之前由非人動(dòng)物(例如小鼠)的內(nèi)源trbc核苷酸序列表達(dá)的trbc蛋白。

68、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可以具有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)人或嵌合trbc(例如人源化trbc)蛋白的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc蛋白包含人源化trbc1蛋白，優(yōu)選還包含人源化trbc2蛋白。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc1蛋白包含胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(優(yōu)選包含或不包含信號(hào)肽)，所述的胞外區(qū)為非人動(dòng)物內(nèi)源或人或人源化的，所述的跨膜區(qū)為非人動(dòng)物內(nèi)源或人源化的，所述的胞質(zhì)區(qū)為非人動(dòng)物內(nèi)源的。在一些實(shí)施例中，所述的人源化trbc2包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(優(yōu)選包含或不包含信號(hào)肽)，所述的胞外區(qū)為非人動(dòng)物內(nèi)源或人或人源化的，所述的跨膜區(qū)為非人動(dòng)物內(nèi)源或人源化的，所述的胞質(zhì)區(qū)為非人動(dòng)物內(nèi)源的。在一些實(shí)施例中，人trbc1和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1(例如小鼠內(nèi)源trbc1)的序列，和/或人trbc2和非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2(例如小鼠內(nèi)源trbc2)的序列是不同的，所以能夠與人trbc1和/或trbc2結(jié)合的抗體不一定能夠與非人動(dòng)物內(nèi)源的trbc1和/或trbc2具有相同的親和力或作用。因此，具有人或人源化胞外區(qū)(優(yōu)選還可以具有人源化的跨膜區(qū))的基因修飾非人動(dòng)物可以更好地評(píng)估靶向人trbc的治療劑在動(dòng)物模型中的作用。

69、在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含人trbc1基因的5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含非人動(dòng)物內(nèi)源(例如小鼠內(nèi)源)trbc1基因5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含人trbc1基因的3’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含非人動(dòng)物內(nèi)源(例如小鼠內(nèi)源)trbc1基因的3’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含人trbc2基因的5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含非人動(dòng)物內(nèi)源(例如小鼠內(nèi)源)trbc2基因5’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含人trbc2基因的3’utr。在一些實(shí)施例中，人源化trbc基因座包含非人動(dòng)物內(nèi)源(例如小鼠內(nèi)源)trbc2基因的3’utr。在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以合理地假設(shè)，基于非人動(dòng)物和人trbc1基因序列的相似性，以及非人動(dòng)物和人trbc2基因序列的相似性，它們似乎受到類(lèi)似的調(diào)節(jié)。如本技術(shù)所示，在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座包含插入或替換的trbc基因人源化非人動(dòng)物，其保留非人動(dòng)物內(nèi)源調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)但包含trbc1編碼序列和/或trbc2編碼序列的人源化，不出現(xiàn)病理現(xiàn)象。在一些實(shí)施例中，trbc基因人源化的雜合或純合的兩種基因修飾小鼠都是正常的。

70、本發(fā)明進(jìn)一步涉及人源化小鼠的trbc基因組dna序列，通過(guò)mrna逆轉(zhuǎn)錄獲得的dna序列與該dna序列一致或互補(bǔ)；表達(dá)其氨基酸序列的構(gòu)建體；包含其構(gòu)建體的細(xì)胞；包括其細(xì)胞的組織或器官。

71、本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)上述方法產(chǎn)生的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，其基因組包含人trbc基因(包括人trbc1基因，優(yōu)選還包括人trbc2基因)。

72、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選的，非人哺乳動(dòng)物為小鼠。

73、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物表達(dá)由人源化trbc基因(包含人源化trbc1基因，優(yōu)選還包含人源化trbc2基因)編碼的蛋白。

74、此外，本發(fā)明還提供了一種攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物模型，所述非人哺乳動(dòng)物模型是通過(guò)本技術(shù)所述構(gòu)建方法獲得的。在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物(如，小鼠)。

75、本發(fā)明還提供了一種來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞系，或原代細(xì)胞培養(yǎng)物，其來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代、或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物、來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的組織、器官或其培養(yǎng)物。當(dāng)其攜帶腫瘤時(shí)來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的腫瘤組織或攜帶腫瘤的非人哺乳動(dòng)物。

76、本發(fā)明提供了一種通過(guò)本技術(shù)描述的任一方法產(chǎn)生的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，提供了非人哺乳動(dòng)物、基因修飾的非人動(dòng)物，所述基因修飾的非人動(dòng)物基因組包含人或人源化trbc的dna。

77、在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物包括本技術(shù)所述基因構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中，提供了一種表達(dá)人或人源化trbc蛋白的非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，提供了一種特異性表達(dá)人或人源化trbc蛋白的細(xì)胞、組織或器官。

78、在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物中人或人源化trbc蛋白的表達(dá)是可控的。如通過(guò)添加特異性誘導(dǎo)物或阻遏物。在一些實(shí)施例中，所述特異性誘導(dǎo)物選自四環(huán)素系統(tǒng)(tet-offsystem/tet-on?system)或他莫昔芬系統(tǒng)(tamoxifen?system)。

79、非人哺乳動(dòng)物可以是本領(lǐng)域已知的任何非人動(dòng)物，其可用于本技術(shù)所述方法中。優(yōu)選的，所述的非人哺乳動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，非人哺乳動(dòng)物是小鼠。

80、對(duì)上述描述的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行遺傳、分子和行為分析。本發(fā)明提供了一種與相同基因型或其他基因型非人哺乳動(dòng)物交配產(chǎn)生的后代。

81、本發(fā)明提供了一種來(lái)源于非人哺乳動(dòng)物或其后代的細(xì)胞系或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。例如可以通過(guò)以下方法制備基于細(xì)胞培養(yǎng)的模型。細(xì)胞培養(yǎng)物可以通過(guò)從非人哺乳動(dòng)物中分離獲得，或者可以使用相同構(gòu)建體和用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得細(xì)胞。包含編碼人或人源化trbc蛋白的dna序列的遺傳結(jié)構(gòu)的整合可以通過(guò)多種方法檢測(cè)。

82、有許多分析方法可用于檢測(cè)外源性dna，包括核酸水平的方法(包含使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)或southern?blot以及原位雜交)和蛋白水平的方法(包括組織化學(xué)分析，免疫印跡分析和體外結(jié)合研究)。此外，目的基因的表達(dá)水平可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的elisa方法進(jìn)行量化。許多標(biāo)準(zhǔn)的分析方法可用于完成定量檢測(cè)。例如，可以使用rt-pcr和雜交方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平，包括rna酶保護(hù)分析法，southern?blot，rna斑點(diǎn)雜交分析(rnadot)。免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)、western?blot也可用于檢測(cè)人或人源化trbc蛋白的存在。

83、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所述的經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物(例如，trbc基因人源化純合小鼠或trbc基因人源化雜合小鼠)可以在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中表達(dá)人或人源化trbc。

84、基因修飾的非人動(dòng)物的構(gòu)建方法

85、基因修飾的非人動(dòng)物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)制備獲得，包括利用胚胎干細(xì)胞的基因打靶技術(shù)、同源重組技術(shù)、crispr/cas9技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)、歸巢核酸內(nèi)切酶或其他分子生物學(xué)技術(shù)。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選使用同源重組技術(shù)。在一些實(shí)施例中，crispr/cas9基因編輯技術(shù)可以構(gòu)建基因修飾的非人動(dòng)物。這些基因組編輯技術(shù)中的許多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且在yin等人的“deliverytechnologies?for?genome?editing,”nature?reviews?drug?discovery?16.6(2017):387-399,中進(jìn)行了描述，該內(nèi)容經(jīng)引用并入本技術(shù)。本發(fā)明還提供了許多其他方法用于基因組編輯，例如，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞顯微注射到去核卵母細(xì)胞中，并將去核卵母細(xì)胞與另一個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞融合。

86、在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)源基因組中包含編碼人trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)源基因組中編碼內(nèi)源trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列被編碼人trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列替換。在一些實(shí)施例中，所述替換發(fā)生在生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、囊胚或成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中。體細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核可以插入去核卵母細(xì)胞中。

87、本發(fā)明提供一種靶向載體。靶向載體包含5’同源臂、人或人源化trbc基因片段和3’同源臂組成的載體。該過(guò)程涉及利用同源重組將人或人源化trbc基因片段導(dǎo)入非人動(dòng)物內(nèi)源基因座。在一些實(shí)施例中，靶位點(diǎn)上游和下游的切割(例如，通過(guò)鋅指核酸酶、talen或crispr)可導(dǎo)致dna雙鏈斷裂，利用同源重組將人或人源化trbc基因片段替換到非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座內(nèi)。

88、在一些實(shí)施例中，制備基因修飾的人源化動(dòng)物的方法包括在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座(或位點(diǎn))，用包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列(包括人trbc1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列，優(yōu)選還包括人trbc2相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列)替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列(包括非人動(dòng)物trbc1相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列，優(yōu)選還包括非人動(dòng)物trbc2相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列)。

89、本發(fā)明還提供了一種建立trbc基因人源化動(dòng)物模型的方法，包括以下步驟：

90、(a)基于本技術(shù)所述的方法提供細(xì)胞(例如受精卵細(xì)胞)；

91、(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞(優(yōu)選在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞)；

92、(c)將培養(yǎng)的細(xì)胞移植到受體雌性非人哺乳動(dòng)物的輸卵管或子宮，允許細(xì)胞在雌性非人哺乳類(lèi)動(dòng)物的子宮中發(fā)育；

93、(d)在步驟(c)中鑒定懷孕雌性的經(jīng)基因修飾的人源化非人哺乳動(dòng)物的后代中的種系傳播。

94、在一些實(shí)施例中，上述方法中的非人哺乳動(dòng)物是小鼠(例如c57bl/6小鼠)。

95、在一些實(shí)施例中，步驟(c)中的非人哺乳動(dòng)物是具有假妊娠(或妊娠)的雌性。

96、在一些實(shí)施例中，用于上述方法的受精卵是c57bl/6受精卵。也可用于本技術(shù)所述方法的其他受精卵包括但不限于fvb/n受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵和dba/2受精卵。

97、受精卵可以來(lái)自任何非人動(dòng)物，例如本技術(shù)所述的任何非人動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，受精卵細(xì)胞來(lái)源于嚙齒動(dòng)物?；驑?gòu)建體可以通過(guò)顯微注射將dna導(dǎo)入受精卵。例如，通過(guò)在顯微注射后培養(yǎng)受精卵，可以將培養(yǎng)的受精卵轉(zhuǎn)移到假孕的非人動(dòng)物身上，然后假孕的非人動(dòng)物生下非人哺乳動(dòng)物，從而產(chǎn)生上述方法中提到的非人哺乳動(dòng)物。

98、在一些實(shí)施例中，制備經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的方法包括修飾非人動(dòng)物的內(nèi)源trbc基因座，例如，通過(guò)在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)控制下，用包含人或嵌合trbc相應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列(例如，基因組dna序列、cds序列或cdna序列)替換非人動(dòng)物內(nèi)源trbc區(qū)域的核苷酸序列，使得非人動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)人或人源化的trbc。

99、在一些實(shí)施例中，制備經(jīng)遺傳修飾的非人動(dòng)物的方法包括在非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因調(diào)控元件之后插入編碼人或人源化trbc蛋白的核苷酸序列和/或輔助序列。在一些實(shí)施例中，輔助序列可以是終止密碼子或隔離子，使得trbc基因人源化動(dòng)物模型可以在體內(nèi)表達(dá)人或人源化trbc蛋白(例如人或人源化trbc1蛋白，優(yōu)選還包含人或人源化trbc2蛋白)。在一些實(shí)施例中，輔助序列包括wpre(whp轉(zhuǎn)錄后反應(yīng)元件)、loxp、stop和/或polya。

100、在一些實(shí)施例中，用于制備基因修飾非人動(dòng)物的方法包括：

101、(1)提供包含人或嵌合trbc基因片段的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒側(cè)翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座；

102、(2)提供一種或多種靶向非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座指導(dǎo)rna(sgrna)；

103、(3)通過(guò)使用步驟(1)的質(zhì)粒、步驟(2)的sgrna和cas9來(lái)修飾細(xì)胞(例如受精卵或胚胎干細(xì)胞)的基因組；

104、(4)將步驟(3)中獲得的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的輸卵管中，或者將步驟(3)中獲得地胚胎干細(xì)胞移植到囊胚中，然后將囊胚移植到假孕雌性小鼠的輸卵管中以產(chǎn)生功能性表達(dá)人源化trbc蛋白的子代小鼠。優(yōu)選所述的方法還包括：

105、(5)將步驟(4)中獲得的子代小鼠交配以獲得純合小鼠。

106、在一些實(shí)施例中，受精卵被crispr用靶向5’-末端靶位點(diǎn)和3’-末端靶位點(diǎn)的sgrna修飾。

107、在一些實(shí)施例中，編碼人源化trbc蛋白的序列與人源調(diào)控元件可操作地連接。

108、在一些實(shí)施例中，編碼人源化trbc蛋白的序列與非人動(dòng)物內(nèi)源調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)可操作地連接。

109、在一些實(shí)施例中，用于制備基因修飾的非人動(dòng)物的方法包括：

110、(1)提供包含人或嵌合trbc基因片段的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒側(cè)翼為5’同源臂和3’同源臂，其中所述5’同源臂和3’同源臂靶向非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座；

111、(2)提供一種或多種靶向非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座的指導(dǎo)rna(sgrna)；

112、(3)通過(guò)將所述人或嵌合trbc基因片段插入到非人動(dòng)物基因組中來(lái)修飾細(xì)胞(例如受精卵或胚胎干細(xì)胞)的基因組。

113、在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc蛋白的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc1蛋白的全部或部分的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc1蛋白的胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的第3-145位、seq?id?no：1的第1-145位或seq?id?no：1的第1-159位的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc2蛋白的全部或部分的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：3的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc2蛋白的胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：3的第3-145位、seq?idno：3的第1-145位或seq?id?no：3的第1-159位的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼內(nèi)源trbc1蛋白的全部或部分的核苷酸序列，和，編碼內(nèi)源trbc2蛋白的全部或部分的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼seqid?no：1和3的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中編碼seq?idno：1的第3-145位、seq?id?no：1的第1-145位或seq?id?no：1的第1-159位，和，編碼seq?idno：3的第3-145位、seq?id?no：3的第1-145位或seq?id?no：3的第1-159位的核苷酸序列缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分缺失。在一些實(shí)施例中，所述的非人動(dòng)物基因組中trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，和，trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分缺失。

114、在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc蛋白的核苷酸序列(例如基因組dna序列、cds序列或cdna序列)替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc1蛋白的全部或部分核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc2蛋白的全部或部分核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc1蛋白胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc1蛋白胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc2蛋白胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼人trbc2蛋白胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼人trbc1蛋白的全部或部分和編碼人trbc2蛋白的全部或部分的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白的全部或部分核苷酸序列和編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼人trbc1蛋白的胞外區(qū)的全部或部分和編碼人trbc2蛋白的胞外區(qū)的全部或部分的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白的胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列和編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白的胞外區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼人trbc1蛋白的胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分和編碼人trbc2蛋白的胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1蛋白的胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列和編碼非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2蛋白的胞外區(qū)和跨膜區(qū)的全部或部分核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?idno：2的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：2的第3-149位核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的第3-145位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：2的第1-149位核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的第1-145位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：2的第1-163位核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的第1-159位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：4的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：3的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：4的第3-144位核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：3的第3-145位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：4的第1-149位核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：3的第1-145位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：4的第1-163位核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?idno：3的第1-159位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼seq?idno：2和4的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1和3的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼seq?id?no：2的第3-149位和seq?id?no：4的第3-144位第核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的第3-145位和seq?id?no：3的第3-145位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼seq?id?no：2的第1-149位和seq?id?no：4的第1-149位第核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?idno：1的第1-145位和seq?id?no：3的第1-145位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼seq?id?no：2的第1-163位和seq?id?no：4的第1-163位第核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的第1-159位和seq?id?no：3的第1-159位核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將人trbc基因的全部或部分(例如基因組dna序列、cds序列或cdna序列)替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將人trbc1基因的全部或部分替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將人trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將人trbc2基因的全部或部分替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含人trbc1基因的全部或部分和人trbc2基因的全部或部分替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的全部或部分和內(nèi)源trbc2基因的全部或部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含人trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分以及人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分以及內(nèi)源trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?id?no：24的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將seq?id?no：26所示核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將編碼seq?idno：25的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：3的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將seq?id?no：27所示核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seqid?no：3的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含編碼seq?id?no：24和25的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1和3的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含seq?id?no：26和27的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中編碼seq?id?no：1和3的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將人和非人動(dòng)物的嵌合序列替換非人動(dòng)物內(nèi)源trbc基因座的相應(yīng)序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含人trb1基因外顯子1的部分至外顯子3的部分、非人動(dòng)物內(nèi)源trbc1基因外顯子3的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子1的部分、人trbc2基因的外顯子1的部分至外顯子3的部分，以及非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因外顯子3的部分至3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列，替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將包含ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142791702-142792735位核苷酸序列、ncbi登錄號(hào)為nc_000007.14的第142801049-142802133位核苷酸序列或其變體(優(yōu)選的，所述的變體包括第142801129位由g突變?yōu)閍、第142802045位由t突變?yōu)閏和第142802078位由a突變?yōu)間)、ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41516207-41523671位核苷酸序列、ncbi登錄號(hào)為nc_000072.7的第41524735-41525760位核苷酸序列的核苷酸序列替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述的構(gòu)建方法包括將seq?id?no：7替換非人動(dòng)物基因組中內(nèi)源trbc1基因的外顯子1的部分至非人動(dòng)物內(nèi)源trbc2基因的3’utr下游至少5bp連續(xù)核苷酸序列。

115、基因修飾的非人動(dòng)物的應(yīng)用

116、在非人動(dòng)物內(nèi)源基因座并在非人動(dòng)物內(nèi)源調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子、5’utr和/或3’utr)的控制下，用同源或直系同源人類(lèi)基因或人類(lèi)序列替換非人動(dòng)物基因或?qū)⑼椿蛑毕低慈祟?lèi)基因或人序列插入非人動(dòng)物中，可以產(chǎn)生具有可能與典型的敲除加轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯著不同的品質(zhì)和特征的非人動(dòng)物。在典型的敲除加轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，內(nèi)源基因座被移除或破壞，全人轉(zhuǎn)基因被插入非人動(dòng)物的基因組中，并可能隨機(jī)整合到基因組中。通常，整合轉(zhuǎn)基因的位置是未知的；通過(guò)人基因和/或蛋白質(zhì)測(cè)定和/或功能測(cè)定的轉(zhuǎn)錄來(lái)測(cè)量人類(lèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

117、表達(dá)人或人源化trbc蛋白的基因修飾非人動(dòng)物，例如，以生理學(xué)上合適的方式，提供了多種用途，包括但不限于開(kāi)發(fā)人類(lèi)疾病和病癥的治療方法，以及評(píng)估這些人類(lèi)治療方法在動(dòng)物模型中的毒性和/或功效。

118、本發(fā)明還提供了一種上述trbc基因修飾的非人動(dòng)物、上述任一構(gòu)建方法獲得的非人動(dòng)物的應(yīng)用。

119、在一些實(shí)施例中，所述應(yīng)用包含：

120、a)涉及人類(lèi)細(xì)胞的與trbc相關(guān)的免疫過(guò)程的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用；

121、b)作為藥理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的與trbc相關(guān)的模型系統(tǒng)中的應(yīng)用；

122、c)涉及生產(chǎn)和利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)疾病模型用于與trbc相關(guān)的病原學(xué)研究和/或用于開(kāi)發(fā)診斷策略和/或用于開(kāi)發(fā)治療策略中的應(yīng)用；

123、d)在體內(nèi)研究人trbc信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑的篩選、藥效檢測(cè)、評(píng)估療效、驗(yàn)證或評(píng)價(jià)中的應(yīng)用；或者，

124、e)研究trbc基因功能，研究針對(duì)人trbc靶位點(diǎn)的藥物、藥效，研究與trbc相關(guān)的腫瘤、炎癥或免疫疾病的治療藥物方面的應(yīng)用。

125、本發(fā)明提供了一種表達(dá)人或人源化trbc蛋白的非人動(dòng)物，該非人動(dòng)物可用于人trbc特異性調(diào)節(jié)劑的篩選。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物是人疾病動(dòng)物模型。如，疾病是遺傳誘導(dǎo)的(敲入或敲除)。在不同的實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物還包含受損的免疫系統(tǒng)，如，經(jīng)過(guò)基因修飾的人源性組織異種移植，包括人實(shí)體瘤(例如，乳腺癌)或血液瘤(例如，白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、淋巴細(xì)胞腫瘤(包括b細(xì)胞腫瘤和/或t細(xì)胞腫瘤))。

126、在一些實(shí)施例中，治療劑(例如靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)阻斷或抑制trbc介導(dǎo)的信號(hào)通路。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)所描述的治療劑可以阻斷trbc復(fù)合物之間的相互作用，從而抑制trbc信號(hào)通路。

127、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)在治療各種免疫疾病方面的有效性。在一些實(shí)施例中，所述免疫疾病包括但不限于gvhd(移植物抗宿主病)、特異性皮炎、銀屑病、過(guò)敏、哮喘、心肌炎、多發(fā)性硬化癥、腎炎、肝炎(優(yōu)選為非酒精性脂肪性肝炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺功能亢進(jìn)、原發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神經(jīng)障礙等。在一些實(shí)施例中，免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特異性皮炎、銀屑病、哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥。

128、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)在治療各種炎癥(例如感染)方面的有效性。在一些實(shí)施例中，所述炎癥包括急性炎癥，也包括慢性炎癥。具體的，包括但不限于變質(zhì)性炎癥、滲出性炎癥(漿液性炎、纖維素性炎、化膿性炎、出血性炎、壞死性炎、卡他性炎)、增生性炎癥、特異性炎癥(結(jié)核、梅毒、麻瘋、淋巴肉芽腫等)。在一些實(shí)施例中，炎癥為炎癥性腸病(ibd)。

129、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療劑(如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)對(duì)治療癌癥的有效性。在一些實(shí)施例中，向非人動(dòng)物施用治療劑，其中所述非人動(dòng)物具有癌癥或腫瘤，檢測(cè)治療劑對(duì)癌癥或腫瘤的抑制作用。在一些實(shí)施例中，所述檢測(cè)包括測(cè)定腫瘤細(xì)胞的大小和/或增殖速率。在一些實(shí)施例中，所述檢測(cè)方法包括游標(biāo)卡尺測(cè)量、流式細(xì)胞檢測(cè)和/或動(dòng)物活體成像檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，所述檢測(cè)包括評(píng)估個(gè)體體重、脂肪量、活化途徑、神經(jīng)保護(hù)活性或代謝變化，所述代謝變化包括食物消耗或水消耗的變化。

130、在一些實(shí)施例中，所述腫瘤細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)被注射到非人動(dòng)物體內(nèi)的癌細(xì)胞(如，癌細(xì)胞來(lái)源于人或非人動(dòng)物)。在一些實(shí)施例中，治療劑上調(diào)或抑制trbc信號(hào)通路。在一些實(shí)施例中，治療劑不上調(diào)或不抑制trbc信號(hào)通路。

131、在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于檢測(cè)治療劑(如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)為激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施例中，本技術(shù)描述的方法可以用來(lái)檢測(cè)治療劑的功能，例如，所述治療劑是否可以上調(diào)免疫應(yīng)答或下調(diào)免疫應(yīng)答，和/或該治療劑是否能夠誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(cmc)或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(adcc)。在一些實(shí)施例中，基因修飾的非人動(dòng)物可用于確定治療受試者疾病(例如腫瘤、炎癥或免疫疾病)的治療劑的有效劑量。在一些實(shí)施例中，對(duì)腫瘤的抑制作用也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定，例如，測(cè)量動(dòng)物中的腫瘤體積，和/或確定腫瘤(體積)抑制率(tgitv)。腫瘤生長(zhǎng)抑制率可以使用公式tgitv(％)＝(1–tvt/tvc)x?100計(jì)算，其中tvt和tvc是治療組和對(duì)照組的平均腫瘤體積(或重量)。

132、在一些實(shí)施例中，治療劑(如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)可以被用于治療各種癌癥(腫瘤)。本發(fā)明所述“癌癥”或“腫瘤”是指具有自主生長(zhǎng)能力的細(xì)胞，即以細(xì)胞生長(zhǎng)迅速增殖為特征的異常狀態(tài)或病癥。該術(shù)語(yǔ)旨在包括所有類(lèi)型的癌性生長(zhǎng)或致癌過(guò)程、轉(zhuǎn)移性組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，無(wú)論組織病理學(xué)類(lèi)型或侵襲性階段如何。本發(fā)明所述“腫瘤”或“腫瘤”包括但不限于淋巴細(xì)胞腫瘤(例如t細(xì)胞腫瘤和/或b細(xì)胞腫瘤)、宮頸癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、膀胱癌、腦膠質(zhì)瘤、肺癌(例如非小細(xì)胞肺癌)、支氣管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和膽管癌、食管癌、腎癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、睪丸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生異常綜合征、以及肉瘤。其中，所述白血病選自急性淋巴細(xì)胞性(成淋巴細(xì)胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞白血病、以及慢性骨髓性白血??；在一些實(shí)施例中，淋巴細(xì)胞腫瘤包括t細(xì)胞腫瘤和/或b細(xì)胞腫瘤。在一些實(shí)施例中，所述淋巴細(xì)胞腫瘤選自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)b細(xì)胞淋巴瘤、t細(xì)胞淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；所述肉瘤選自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、以及軟骨肉瘤。在一些實(shí)施例中，所述腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、內(nèi)分泌癌、頭頸癌、胃腸癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、間皮組織腫瘤、口咽腫瘤、女性生殖系統(tǒng)癌癥或腦膜瘤。在一些實(shí)施例中，所述腫瘤包括實(shí)體瘤或血液瘤。在一些實(shí)施例中，所述的腫瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、女性生殖系統(tǒng)癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴細(xì)胞腫瘤(例如t細(xì)胞腫瘤和/或b細(xì)胞腫瘤)、頭頸癌、肝癌或肺癌中的一種或兩種以上。

133、本發(fā)明還提供了一種確定治療劑(如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)毒性的檢測(cè)方法。所述方法包括向所述非人動(dòng)物施用治療劑，評(píng)估非人動(dòng)物的體重變化或進(jìn)行血液檢查。在一些實(shí)施例中，所述的血液檢查包括但不限于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容和/或血紅蛋白含量。在一些實(shí)施例中，治療劑可使紅細(xì)胞(rbc)、血細(xì)胞比容或血紅蛋白降低20％、30％、40％或50％以上。在一些實(shí)施例中，非人動(dòng)物的體重與對(duì)照組(如，未用治療劑處理的非人動(dòng)物的平均體重)相比至少小5％、10％、20％、30％或40％。

134、本發(fā)明還提供了一種通過(guò)本技術(shù)所述方法構(gòu)建的動(dòng)物模型在開(kāi)發(fā)與人類(lèi)細(xì)胞免疫過(guò)程相關(guān)的產(chǎn)品、制造人抗體、或用于藥理學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的模型系統(tǒng)。

135、在一些實(shí)施例中，提供了一種通過(guò)本技術(shù)描述的方法生成的動(dòng)物模型在生產(chǎn)和利用人體細(xì)胞的免疫過(guò)程的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)疾病模型、研究病原體、或制定新的診斷策略和/或治療策略。

136、本發(fā)明還提供了通過(guò)本技術(shù)所述方法生成的動(dòng)物模型來(lái)篩選、驗(yàn)證、評(píng)估或研究trbc基因功能、人trbc抗體、人trbc靶點(diǎn)相關(guān)疾病(例如腫瘤、炎癥或免疫疾病，優(yōu)選為腫瘤)的藥物或有效性。

137、在一些實(shí)施例中，本技術(shù)提供了一種驗(yàn)證tcr-t、car-t和/或其他免疫療法(例如，t細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移療法)的體內(nèi)療效的方法。例如，所述方法包括將人腫瘤細(xì)胞移植到本技術(shù)所述的非人動(dòng)物中，并將人car-t應(yīng)用于具有人腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物。car-t治療的有效性可以確定和評(píng)估。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物選自通過(guò)本技術(shù)所述方法制備的trbc基因人源化非人動(dòng)物，通過(guò)本技術(shù)所描述的方法產(chǎn)生的雙基因或多基因人源化非人動(dòng)物(或其后代)，表達(dá)人或人源化trbc蛋白的非人動(dòng)物，或本技術(shù)所述的攜帶腫瘤或炎性動(dòng)物模型。在一些實(shí)施例中，tcr-t、car-t和/或其他免疫療法可以治療所述的trbc相關(guān)疾病(例如腫瘤、炎癥或免疫疾病)。在一些實(shí)施例中，tca-t、car-t和/或其他免疫療法提供了用于治療所述的trbc相關(guān)疾病(例如腫瘤、炎癥或免疫疾病)的評(píng)估方法。

138、兩個(gè)或多個(gè)人或嵌合基因的非人動(dòng)物模型

139、本發(fā)明還提供了一種具有兩個(gè)或多個(gè)人或嵌合基因的動(dòng)物模型或非人動(dòng)物。該非人動(dòng)物或動(dòng)物模型可以包含人或嵌合trbc基因和編碼額外的人或嵌合蛋白的序列。

140、在一些實(shí)施例中，所述額外的人或嵌合蛋白包括nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還表達(dá)人或人源化nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4蛋白中的至少一種。

141、本發(fā)明還提供了一種兩個(gè)或多個(gè)人或嵌合基因的非人動(dòng)物的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：

142、(一)提供上述的構(gòu)建方法獲得非人動(dòng)物；

143、(二)將步驟(一)提供的非人動(dòng)物與其他基因修飾的非人動(dòng)物交配、體外受精或直接進(jìn)行基因編輯，并進(jìn)行篩選，得到多基因修飾的非人動(dòng)物。

144、在一些實(shí)施例中，所述其他基因修飾的非人動(dòng)物包括基因nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的一種或兩種以上的組合人源化的非人動(dòng)物。

145、在一些實(shí)施例中，trbc基因人源化直接在具有人或嵌合nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4中的至少一種基因修飾的非人動(dòng)物上進(jìn)行。

146、由于這些蛋白可能涉及不同的機(jī)制，因此靶向其中兩種或多種蛋白的聯(lián)合療法可能是一種更有效的治療方法。事實(shí)上，許多相關(guān)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，并顯示出良好的效果。多基因修飾的非人動(dòng)物模型可用于確定靶向兩種或多種蛋白的聯(lián)合療法的有效性，例如，治療劑(例如，靶向trbc的抗體、靶向trbc核酸藥和/或多肽藥物)，以及用于治療疾病(例如，腫瘤、炎癥或免疫疾病，優(yōu)選腫瘤)的附加治療劑。所述方法包括向非人動(dòng)物施用治療劑和附加治療劑，其中非人動(dòng)物具有疾病(例如，腫瘤、炎癥或免疫疾病)的，并確定聯(lián)合治療對(duì)疾病的影響。在一些實(shí)施例中，所述附加治療劑是特異性結(jié)合nkg2d、tfr1、nkp46、icos、lag3、4-1bb、cd40、tigit、cd27、cd28、b7h3、ox40、pd-1、pd-l1或ctla4的抗體，或靶向上述靶點(diǎn)的核酸藥和/或多肽藥物。在一些實(shí)施例中，所述附加治療劑是抗ctla4抗體(例如，ipilimumab)、抗pd-1抗體(例如，帕博利珠單抗或納武利尤單抗(nivolumab))或抗pd-l1抗體。在一些實(shí)施例中，所述非人動(dòng)物還包括編碼人或人源化pd-1的序列、編碼人或人源化pd-l1的序列、或編碼人或人源化ctla-4的序列。在一些實(shí)施例中，所述腫瘤包括一個(gè)或多個(gè)表達(dá)pd-l1和/或pd-l2的腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該組合治療方法用于治療各種癌癥(腫瘤)。在一些實(shí)施例中，組合治療被設(shè)計(jì)用于治療所述的免疫疾病，例如銀屑病。在一些實(shí)施例中，所述的方法可用于評(píng)估與一些其他方法的組合治療。可單獨(dú)使用或與本技術(shù)所述方法結(jié)合使用的治療癌癥的方法包括，例如，用化學(xué)療法治療受試者，例如，樟腦堿、多柔比星、順鉑、卡鉑、丙卡巴嗪、甲氯雷他明、環(huán)磷酰胺、阿霉素、異環(huán)酰胺、馬法蘭、氯丁嘧啶、比硫芬、亞硝基脲、達(dá)克寧、柔紅霉素、博萊霉素、普利霉素、絲裂霉素、依托泊苷、維拉帕米、鬼臼毒素、三苯氧胺、紫杉醇、轉(zhuǎn)鉑、5-氟脲酸、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花素和/或甲氨蝶呤?；蛘?，除此之外，所述方法可以包括對(duì)受試者進(jìn)行手術(shù)，以移除癌癥的至少一部分，例如，從患者身上移除腫瘤的一部分或全部。