本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、萊茵衣藻(chlamydomonas?reinhardtii)是單細(xì)胞真核生物，具有光合酵母的稱號(hào)，同時(shí)也是典型的模式生物之一。其生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、培養(yǎng)成本低；細(xì)胞周期短、繁殖力強(qiáng)；衣藻的全基因組測(cè)序已完成，cdna文庫(kù)已建立，各種分子生物學(xué)技術(shù)手段齊全，技術(shù)成熟，長(zhǎng)期以來一直被用作分子生物學(xué)和遺傳實(shí)驗(yàn)的模型藻株。衣藻作為綠色細(xì)胞工廠，在食品、養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域的重組蛋白表達(dá)具有廣泛應(yīng)用。
2、熱休克蛋白70a(hsp70a)啟動(dòng)子和rubisco小亞基(rbcs2)啟動(dòng)子均已被確定為衣藻中可高表達(dá)基因的天然啟動(dòng)子。schrodam等人在2000年首次將hsp70a-rbcs2啟動(dòng)子融合開發(fā)了一種嵌合啟動(dòng)子，從而顯著提高了基因表達(dá)。hsp70a啟動(dòng)子本身可能具有轉(zhuǎn)基因高誘導(dǎo)性，當(dāng)hsp70a啟動(dòng)子位于rbcs2啟動(dòng)子上游時(shí)起增強(qiáng)子的作用，衣藻中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可能性顯著提高。因此，尋求一種帶hsp70a-rbcs2啟動(dòng)子(hsrb啟動(dòng)子)和rbcs2?intron組合片段的質(zhì)粒載體及構(gòu)建方法顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體及其構(gòu)建方法，不僅可實(shí)現(xiàn)抗性蛋白與目的蛋白相偶聯(lián)表達(dá)以提高外源蛋白表達(dá)成功率，同時(shí)由于添加了強(qiáng)啟動(dòng)子組合hsrb片段，從而可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)目的基因表達(dá)的目的；因此，本發(fā)明可提高陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子獲得率和目的基因的穩(wěn)定高表達(dá)，為研究目的蛋白在萊茵衣藻細(xì)胞中結(jié)構(gòu)、定位與功能提供便利。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體，包括hsp70a-rbcs2啟動(dòng)子、rbcs2?intron、目的基因插入位點(diǎn)ecorv、3’末端的3×ha標(biāo)簽、rbcs2終止子、tub2啟動(dòng)子、潮霉素b(hyg+)篩選基因和rbcs2終止子；hsp70a-rbcs2啟動(dòng)子簡(jiǎn)稱為hsrb啟動(dòng)子，其中，hsrb啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?idno.2所示，rbcs2?intron的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，目的基因插入位點(diǎn)ecorv的核苷酸序列為gatatc，3’末端的3×ha標(biāo)簽的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，tub2啟動(dòng)子的核酸序列如seq?id?no.5所示，潮霉素b(hyg+)篩選基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示，rbcs2終止子的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
3、本發(fā)明還提供了一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
4、(1)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的骨架：以質(zhì)粒phyg-3ha為模板，質(zhì)粒phyg-3ha的核苷酸序列如seq?id?no.8所示，用ecorv進(jìn)行酶切，可獲得大小為4777bp的線性化片段；對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，將4777bp片段進(jìn)行回收，檢測(cè)dna濃度后待用；
5、(2)構(gòu)建hsrb啟動(dòng)子和rbcs2?intron組合片段：以質(zhì)粒pjmg-aphviii為模板，質(zhì)粒pjmg-aphviii的核苷酸序列如seq?id?no.9所示，使用上游引物si-hsrb-f和下游引物si-hsrb-r搭配，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.10和seq?id?no.11所示，擴(kuò)增1658-2319bp之間hsrb啟動(dòng)子和rbcs2?intron組合片段，長(zhǎng)度為701bp；擴(kuò)增后的組合片段去掉了ecor?i位點(diǎn)序列g(shù)aattc，同時(shí)帶有步驟(1)構(gòu)建的載體骨架片段ecorv切點(diǎn)兩端的同源序列；
6、(3)將所得hsrb啟動(dòng)子和rbcs2?intron組合原件進(jìn)行膠回收，測(cè)定dna片段濃度，并通過同源重組法將片段整合進(jìn)入步驟(1)得到的質(zhì)粒骨架結(jié)構(gòu)片段4777bp，即成表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體，全長(zhǎng)為5433bp。
7、優(yōu)選的，所述步驟(2)中pcr的體系為：
8、
9、
10、；pcr的程序?yàn)椋?/p>
11、
12、優(yōu)選的，所述步驟(1)中，電泳分析是利用1％瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，純化回收是使用膠回收試劑盒純化。
13、優(yōu)選的，步驟(3)中，所述同源重組法就是將hsrb啟動(dòng)子和rbcs2?intron組合片段通過同源重組酶與質(zhì)粒骨架結(jié)構(gòu)片段4777bp于50℃反應(yīng)1h進(jìn)行重組。
14、本發(fā)明還提供一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體在篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻株中的應(yīng)用，具體應(yīng)用過程為：將所需表達(dá)的目標(biāo)基因片段通過同源重組或者酶切連接插入至表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的ecor?v位點(diǎn)，構(gòu)建成最終的目標(biāo)基因表達(dá)質(zhì)粒；將最終的目標(biāo)基因表達(dá)質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化入待測(cè)衣藻細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化藻株穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)蛋白，從而篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻株；所述篩選過程包括配制tap液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的衣藻細(xì)胞；限制性內(nèi)切酶酶切使得重組質(zhì)粒線性化；配制hyg+抗性篩選平板；收集細(xì)胞和方波電擊轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定。
15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
16、(1)本發(fā)明成功構(gòu)建了一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體，將所需表達(dá)的片段插入phyg-hsrb-intron-3ha中構(gòu)建新的質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞dh5α后進(jìn)行菌液培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，利用合適的限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒酶切獲得線性化片段，然后通過電擊轉(zhuǎn)化插入實(shí)驗(yàn)藻株中，該方法通過抗性基因hyg+、目的基因插入位點(diǎn)ecorv和蛋白標(biāo)簽3×ha，實(shí)現(xiàn)了在萊茵衣藻中進(jìn)行目的基因蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，在單一載體上同時(shí)表達(dá)抗性篩選基因和目的基因，使抗性篩選基因與目的基因的表達(dá)相偶聯(lián)，提高陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的獲得率，從而獲得能夠穩(wěn)定目的蛋白表達(dá)，有利于研究目標(biāo)蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)、定位與功能的相關(guān)分子機(jī)制。
17、(2)本發(fā)明通過在phyg-3ha質(zhì)粒中加入hsrb啟動(dòng)子和rbcs2?intron組合片段，不僅可顯著提高衣藻中的轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合表達(dá)的可能性，同時(shí)外源基因的轉(zhuǎn)化效率還可顯著增加，進(jìn)而為獲得穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的藻株提高效率，為研究目的蛋白結(jié)構(gòu)、定位與功能提供便利。
1.一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體，其特征在于，包括hsp70a-rbcs2啟動(dòng)子、rbcs2?intron、目的基因插入位點(diǎn)ecorv、3’末端的3×ha標(biāo)簽、rbcs2終止子、tub2啟動(dòng)子、潮霉素b(hyg+)篩選基因和rbcs2終止子；hsp70a-rbcs2啟動(dòng)子簡(jiǎn)稱為hsrb啟動(dòng)子，其中，hsrb啟動(dòng)子的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，rbcs2?intron的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，目的基因插入位點(diǎn)ecorv的核苷酸序列為gatatc，3’末端的3×ha標(biāo)簽的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，tub2啟動(dòng)子的核酸序列如seq?id?no.5所示，潮霉素b(hyg+)篩選基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示，rbcs2終止子的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的核苷酸序列如seq?idno.1所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，pcr的體系為：
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中，電泳分析是利用1％瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，純化回收是使用膠回收試劑盒純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述同源重組法就是將hsrb啟動(dòng)子和rbcs2?intron組合片段通過同源重組酶與質(zhì)粒骨架結(jié)構(gòu)片段4777bp于50℃反應(yīng)1h進(jìn)行重組。
6.一種如權(quán)利要求1所述的萊茵衣藻通用表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體在篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻株中的應(yīng)用，具體應(yīng)用過程為：將所需表達(dá)的目標(biāo)基因片段通過同源重組或者酶切連接插入至表達(dá)質(zhì)粒phyg-hsrb-intron-3ha載體的ecor?v位點(diǎn)，構(gòu)建成最終的目標(biāo)基因表達(dá)質(zhì)粒；將最終的目標(biāo)基因表達(dá)質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化入待測(cè)衣藻細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化藻株穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)蛋白，從而篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化藻株；所述篩選過程包括配制tap液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化的衣藻細(xì)胞；限制性內(nèi)切酶酶切使得重組質(zhì)粒線性化；配制hyg+抗性篩選平板；收集細(xì)胞和方波電擊轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定。