本發(fā)明屬于腸道菌群檢測，尤其設(shè)計(jì)一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒及檢測方法
背景技術(shù)：
1、自身免疫性肝炎(autoimmune?hepatitis，aih)是遺傳易感個(gè)體在環(huán)境等因素誘導(dǎo)下出現(xiàn)的t細(xì)胞介導(dǎo)的一種慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病，以血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高、血清自身抗體陽性、高免疫球蛋白g血癥和界面性肝炎為主要特征，如未及時(shí)干預(yù)將發(fā)展至肝硬化、肝衰竭等。該疾病目前發(fā)病率升高、發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上尚無可以完全治愈的藥物。
2、在人體腸道中定居有大量細(xì)菌，即"腸道菌群"，這些腸道菌群被認(rèn)為在人體中具有重要的作用，能極大的影響人體身體健康，是許多慢性疾病，如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝等的重要誘因。最新的研究表明，腸道菌群的變化與自身免疫性肝炎有密切的關(guān)系，調(diào)整腸道菌群可能是一個(gè)新的治療此類疾病的方向。因此，建立準(zhǔn)確，快速的腸道菌群的檢測系統(tǒng)和方法具有重要意義。
3、現(xiàn)有的腸道菌群檢測中，標(biāo)本的采集基本為新鮮糞便樣品。腸道菌群的研究方法主要有傳統(tǒng)法和分子生物學(xué)的方法。傳統(tǒng)法的培養(yǎng)法和鏡鑒法是早期的腸道菌群研究方法。其中細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，耗時(shí)長，并且腸道菌群的種類繁多，在實(shí)驗(yàn)室中難于快速高效地培養(yǎng)，為檢測增加了難度。分子生物學(xué)技術(shù)檢測糞便中細(xì)菌基因組dna，是當(dāng)前研究人體腸道菌群的重要方法。數(shù)字pcr(digital?pcr,dpcr)能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)分子的絕對(duì)計(jì)數(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、絕對(duì)定量且準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒及檢測方法，通過根據(jù)腸道細(xì)菌16s?rrna基因序列，快速精確檢測人體內(nèi)腸道微生物情況以診斷疾病的發(fā)生。
2、本發(fā)明的技術(shù)方案：一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒，包括有六種檢測自身免疫性肝炎腸道菌群的引物探針組；
3、所述第一引物探針組包括seq?id?no:1～2所示核苷酸序列的引物和seq?id?no:3所示核苷酸序列的探針；
4、所述第二引物探針組包括seq?id?no:4～5所示核苷酸序列的引物，seq?id?no:6所示核苷酸序列的探針；
5、所述第三引物探針組包括seq?id?no:7～8所示核苷酸序列的引物和seq?id?no:9所示核苷酸序列的探針；
6、所述第四引物探針組包括seq?id?no:10～11所示核苷酸序列的引物和seq?idno:12所示核苷酸序列的探針；
7、所述第五引物探針組包括seq?id?no:13～14所示核苷酸序列的引物和seq?idno:15所示核苷酸序列的探針；
8、所述第六引物探針組包括seq?id?no:16～17所示核苷酸序列的引物和seq?idno:18所示核苷酸序列的探針；
9、所述六種引物探針組用于檢測鏈球菌屬、糞球菌屬、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、嗜血桿菌屬、產(chǎn)丁酸腸桿菌屬至少一種菌屬。
10、采用上述技術(shù)方案，該自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒通過設(shè)計(jì)針對(duì)鏈球菌屬、考拉桿菌屬、嗜血桿菌屬、巨單胞菌屬、糞球菌屬和產(chǎn)丁酸腸桿菌屬的特異性引物和探針，具有高特異性、高靈敏度和快速高效的特點(diǎn)，能夠精準(zhǔn)檢測患者腸道菌群的變化，為自身免疫性肝炎的診斷提供可靠的微生物標(biāo)志物。
11、本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括：
12、步驟1，樣本制備：以受試者糞便作為原始樣本，利用核酸提取試劑提取基因組dna或?qū)rna轉(zhuǎn)換為cdna；
13、步驟2，dpcr反應(yīng)液配制：將步驟1制備的樣本分別與六組引物探針組各個(gè)正向和反向引物以及探針混合；
14、步驟3，微滴制備：通過微流控或微孔板與油相將pcr反應(yīng)體系分成油包水液滴，每個(gè)液滴包含一個(gè)或零個(gè)目標(biāo)dna分子；
15、步驟4，pcr擴(kuò)增：將步驟3制備的每個(gè)液滴中單獨(dú)進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
16、步驟5，微滴讀?。鹤x取每個(gè)液滴的熒光值，確定陰陽性液滴數(shù)，以得到原始樣品中陽性液滴的比例；
17、步驟6，數(shù)據(jù)分析：分析pcr結(jié)果，確定原始樣品中鏈球菌屬、糞球菌屬、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、嗜血桿菌屬、產(chǎn)丁酸腸桿菌屬的dna模板濃度并鑒定出與自身免疫性肝炎相關(guān)的標(biāo)志性細(xì)菌。
18、采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的試劑盒操作簡便、成本低廉，適用于臨床診斷和疾病研究，同時(shí)為自身免疫性肝炎的早期診斷、病情監(jiān)測和療效評(píng)估提供了有力工具。
1.一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒，其特征在于，包括有六種檢測自身免疫性肝炎腸道菌群的引物探針組；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒，其特征在于，所述六種引物探針組用于檢測鏈球菌屬、糞球菌屬、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬、嗜血桿菌屬、產(chǎn)丁酸腸桿菌屬中至少一種菌屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種自身免疫性肝炎相關(guān)腸道菌群檢測試劑盒，其特征在于，包括用于pcr擴(kuò)增的檢測試劑和核酸提取試劑。
4.一種使用如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行腸道菌群的檢測方法，其特征在于，包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腸道菌群的檢測方法，其特征在于，所述步驟6中根據(jù)鏈球菌屬和嗜血桿菌屬含量升高，以及糞球菌屬、考拉桿菌屬、巨單胞菌屬和產(chǎn)丁酸腸桿菌屬含量降低的特征進(jìn)行鑒定。