本發(fā)明屬于質(zhì)譜流式分析，具體涉及一種基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（mass?cytometry）被認(rèn)為是被第二代的細(xì)胞流式分析技術(shù)，可以在短時間內(nèi)同時檢測數(shù)百萬個單細(xì)胞上的幾十種生物標(biāo)志物，該技術(shù)使用金屬標(biāo)簽抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光抗體，從而徹底解決了熒光基團之間的串色及自發(fā)熒光等問題，具有通道多、背景低、數(shù)據(jù)質(zhì)量高等特點。質(zhì)譜流式細(xì)胞儀誕生于2009年，經(jīng)過十多年的發(fā)展，其儀器已經(jīng)趨于成熟，其理論通道數(shù)為75至209道爾頓的135個質(zhì)量數(shù)。目前，質(zhì)譜流式所用的商品化元素標(biāo)簽是基于聚合物的元素標(biāo)簽，基于聚合物的元素標(biāo)簽上結(jié)合了大環(huán)螯合物，大環(huán)螯合物與三價的稀土金屬離子有較強的螯合能力，但由于金屬穩(wěn)定同位素的限制，目前只開發(fā)出了40多個通道，超過60%的同位素通道仍然沒有得到實際應(yīng)用；另外，每個聚合物標(biāo)簽上只能偶聯(lián)100～150個金屬離子，靈敏度有限，無法對低豐度細(xì)胞標(biāo)志物進行檢測。因此，當(dāng)前迫切需要開發(fā)適用于質(zhì)譜流式分析的更高靈敏度、更多通道數(shù)的元素標(biāo)簽，以促進質(zhì)譜流式技術(shù)的發(fā)展。

2、納米顆粒具有較多的金屬原子數(shù)目，是質(zhì)譜流式分析非常有潛力的標(biāo)簽。目前，已經(jīng)報道了利用納米顆粒標(biāo)簽（如銀納米顆粒、聚合物點、氧化鉭納米顆粒、金屬有機框架以及聚苯乙烯納米顆粒等）進行質(zhì)譜流式分析的案例。雖然已有諸多嘗試，但已開發(fā)的納米顆粒標(biāo)簽也有明顯的問題：一方面是納米顆粒對生物大分子和細(xì)胞表面的非特異性吸附會顯著增加背景信號，另一方面是目前可以使用的納米顆粒種類有限，無法滿足質(zhì)譜流式幾十種通道的同時檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明為了克服現(xiàn)有質(zhì)譜流式標(biāo)簽的缺陷和不足，提供一種基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽及其制備方法與應(yīng)用，該質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽具有更高靈敏度、更多通道數(shù)，在質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)、成像質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)和組織免疫成像中具有應(yīng)用前景。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽，包括金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒和修飾在所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒表面的抗體，所述金屬包括元素周期表中元素序數(shù)38（鍶，sr）到83（鉍，bi）中的金屬元素中的至少一種。

4、在本發(fā)明的一些實施例中，所述金屬選自稀土金屬釔（y）、鑭（la）、鈰（ce）、鐠（pr）、?釹(nd)、釤（sm）、銪（eu）、?釓（gd）、?鋱（tb）、鏑（dy）、?鈥（ho）、鉺（er）、銩（tm）、鐿（yb）、镥（lu）中的至少一種；和/或，

5、所述基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽的直徑為8.0～12.5nm；

6、所述基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽中，平均每個去鐵蛋白納米顆粒填充300～800個金屬原子；和/或，

7、所述抗體為表面具有二硫鍵的抗體；優(yōu)選地，所述抗體包括anti-cd3、anti-cd4、anti-cd8、anti-cd45中的任一種；和/或，

8、所述基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽中，所述抗體通過n-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺（nhs-peg-mal）與所述去鐵蛋白納米顆粒偶聯(lián)。

9、第二方面，本發(fā)明提供上述任一項所述的基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽的制備方法，包括如下步驟：

10、s1、提供所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒；

11、s2、提供所述抗體；

12、s3、使所述抗體通過n-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺（nhs-peg-mal）偶聯(lián)在所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒表面。

13、上述的制備方法中，進一步地，步驟s3中的偶聯(lián)包括如下步驟：

14、s31、將所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒與nhs-peg-mal共同孵育，通過去鐵蛋白納米顆粒表面自帶的氨基（-nh2）與所述nhs-peg-mal中的-nhs基團反應(yīng)，以在所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒表面修飾上-mal基團；

15、s32、將所述抗體與三(2-羧基乙基)磷鹽酸鹽（tcep）共同孵育，以將所述抗體表面的二硫鍵還原為巰基（-sh）；

16、s33、將步驟s31得到的表面修飾了-mal基團的金屬填充去鐵蛋白納米顆粒與步驟s32得到的經(jīng)tecp處理的抗體共同孵育，通過-mal與-sh的反應(yīng)，使所述抗體偶聯(lián)在所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒表面。

17、上述的制備方法中，更進一步地，步驟s31中，所述nhs-peg-mal與所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒的摩爾比為（1000～5000）：1，所述共同孵育為在?37℃下反應(yīng)2~4小時。

18、上述的制備方法中，更進一步地，步驟s32中，所述tcep和所述抗體的摩爾比為（100～1000）：1，所述共同孵育為在37℃下反應(yīng)30～60min。

19、上述的制備方法中，更進一步地，步驟s33中，所述經(jīng)tecp處理的抗體與所述表面修飾了-mal基團的金屬填充去鐵蛋白納米顆粒的摩爾比為（5～50）：1，所述共同孵育為在37℃下反應(yīng)60～120min。

20、上述的制備方法中，進一步地，步驟s1中所述金屬填充的去鐵蛋白納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

21、s11、將所述金屬的陽離子溶液加入至所述去鐵蛋白溶液中，同時攪拌以使金屬陽離子進入去鐵蛋白的空腔中，繼續(xù)攪拌持續(xù)1～2小時；

22、s12、將能與所述金屬陽離子發(fā)生沉淀反應(yīng)的陰離子溶液加入步驟s11得到的混合液中，同時攪拌以使去鐵蛋白的空腔中形成金屬鹽沉淀核心，繼續(xù)攪拌持續(xù)1～2小時。

23、上述的制備方法中，更進一步地，步驟s11中，所述去鐵蛋白溶液濃度為0.5～2mg/ml，溶劑為ph為7.4～7.6的tris-hcl緩沖液；所述金屬陽離子溶液的濃度為1～20mm，添加速度為5～20μl/min；所述去鐵蛋白溶液與所述金屬陽離子溶液的體積比為1ml：（100～200μl）；步驟s12中，所述陰離子溶液的濃度為0.1～0.5m，添加速度為5～20μl/min；所述金屬陽離子溶液與所述陰離子溶液的體積比為（0.5～2）:1。

24、第三方面，本發(fā)明提供上文任一項所述的基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽或上文任一項所述的方法制備的基于去鐵蛋白納米顆粒的質(zhì)譜流式元素標(biāo)簽在1）質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)、2）成像質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)或3）組織免疫成像中作為質(zhì)譜金屬元素標(biāo)簽對細(xì)胞或組織中的生物分子標(biāo)志物進行檢測中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明具有如下有益效果：

26、本發(fā)明采用的去鐵蛋白納米顆粒質(zhì)譜流式元素探針具有以下優(yōu)點：（1）去鐵蛋白來源于生物體，具有良好的生物相容性；（2）去鐵蛋白結(jié)構(gòu)均一，單分散性和穩(wěn)定性好，因此合成的納米顆粒標(biāo)簽具有良好的均勻性、分散性、穩(wěn)定性和可重現(xiàn)性。（3）去鐵蛋白籠理論上不僅可以摻雜稀土元素，還可以填充幾乎所有的無機金屬納米材料，而不依賴金屬螯合劑，理論通道數(shù)比聚合物標(biāo)簽要多；（4）與現(xiàn)有的商品化聚合物標(biāo)簽相比，去鐵蛋白納米顆粒標(biāo)簽可以裝載更多的金屬離子（300～800），因此具有更高的靈敏度；（5）去鐵蛋白易溶于水，易于在水溶液體系中對細(xì)胞實現(xiàn)標(biāo)記，非特異性吸附低，因此背景信號低；（6）本發(fā)明制備方法各步驟成熟、合成工藝操作簡單、尺寸均一，大大降低了質(zhì)譜流式檢測試劑的成本。