本發(fā)明涉及n糖檢測(cè)，尤其涉及一種燕窩糖蛋白上n糖的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、現(xiàn)有技術(shù)中，糖蛋白糖基化修飾是蛋白翻譯后修飾最重要的和最關(guān)鍵的修飾之一，對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及生物活性具有深遠(yuǎn)影響。也是研究和評(píng)價(jià)燕窩質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。燕窩是雨燕科金絲燕在繁殖的季節(jié)用唾液及其絨羽筑建而成的窩巢，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。燕窩含有豐富的糖蛋白，既有n－糖蛋白，也有o－糖蛋白，且以n－連接形式為主。其中n糖鏈型的多樣性和獨(dú)特性不僅直接關(guān)系到其藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健功能，還是鑒別真?zhèn)危u(píng)估品質(zhì)的重要標(biāo)志。

2、中國(guó)專利公開(kāi)號(hào)：cn103675085a公開(kāi)了一種檢測(cè)人血清中免疫球蛋白n糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟：人血清中免疫球蛋白的純化，免疫球蛋白上n糖鏈的釋放，釋放后的n糖鏈的純化，以及通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析。由此可見(jiàn)，所述一種檢測(cè)人血清中免疫球蛋白n糖鏈結(jié)構(gòu)的方法存在由于質(zhì)譜技術(shù)的耗時(shí)長(zhǎng)且通量低的局限性導(dǎo)致的效率下降，由于在對(duì)n糖鏈提純的過(guò)程中由于提純條件不符合糖蛋白的適應(yīng)條件導(dǎo)致n糖鏈的連接緊密性下降進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)n糖鏈提純的準(zhǔn)確性下降的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明提供一種燕窩糖蛋白上n糖的檢測(cè)方法，用以克服現(xiàn)有技術(shù)中由于質(zhì)譜技術(shù)的耗時(shí)長(zhǎng)且通量低的局限性導(dǎo)致的效率下降，由于在對(duì)n糖鏈提純的過(guò)程中由于提純條件不符合糖蛋白的適應(yīng)條件導(dǎo)致n糖鏈的連接緊密性下降進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)n糖鏈提純的準(zhǔn)確性下降的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種燕窩糖蛋白上n糖的檢測(cè)方法，包括：

3、獲取歷史數(shù)據(jù)中若干n糖鏈的長(zhǎng)度；

4、將所述若干n糖鏈的長(zhǎng)度與數(shù)據(jù)庫(kù)中的同種n糖鏈的長(zhǎng)度進(jìn)行對(duì)比以確定緩沖液清洗過(guò)程的離心機(jī)轉(zhuǎn)速；

5、按照所述轉(zhuǎn)速對(duì)燕窩糖蛋白依次進(jìn)行提取和純化以輸出純化糖蛋白溶液；

6、根據(jù)n糖鏈的結(jié)構(gòu)與所述數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)庫(kù)中燕窩糖蛋白的分子排列結(jié)構(gòu)的對(duì)比結(jié)果確定所述燕窩糖蛋白是否存在斷裂；

7、若判定所述燕窩糖蛋白存在斷裂，則執(zhí)行蛋白斷裂調(diào)整方式，包括對(duì)所述燕窩蛋白質(zhì)的純化結(jié)束時(shí)刻與水解酶的加入時(shí)刻的間隔時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)整，

8、或，根據(jù)n糖鏈的長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)差與所述水解酶的ph值的擬合度確定變性液的ph值；

9、若判定所述燕窩糖蛋白不存在斷裂，則不執(zhí)行所述蛋白斷裂調(diào)整方式，并將所述水解酶加入所述純化糖蛋白溶液以將所述燕窩糖蛋白中的n糖鏈進(jìn)行切割釋放；

10、使用標(biāo)記溶液對(duì)所述n糖鏈進(jìn)行標(biāo)記以輸出標(biāo)記n糖鏈溶液，并采用磁珠懸浮離心的方式對(duì)所述標(biāo)記n糖鏈溶液中的n糖鏈進(jìn)行純化以輸出純化n糖鏈溶液；

11、采集所述純化n糖鏈溶液的濃度，并根據(jù)所述濃度和所述擬合度確定電泳分離過(guò)程的上樣電壓；

12、按照所述上樣電壓對(duì)所述純化n糖鏈溶液進(jìn)行電泳分離以得到電泳圖譜，對(duì)所述電泳圖譜進(jìn)行分析以得到燕窩糖蛋白的n糖鏈結(jié)構(gòu)信息。

13、進(jìn)一步地，確定緩沖液清洗過(guò)程的離心機(jī)轉(zhuǎn)速，包括：

14、獲取所述若干n糖鏈的長(zhǎng)度，并計(jì)算平均長(zhǎng)度；

15、獲取所述數(shù)據(jù)庫(kù)中同種n糖鏈的長(zhǎng)度，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)平均長(zhǎng)度；

16、根據(jù)所述平均長(zhǎng)度與所述標(biāo)準(zhǔn)平均長(zhǎng)度計(jì)算平均長(zhǎng)度差值；

17、若所述平均長(zhǎng)度差值大于預(yù)設(shè)平均長(zhǎng)度差值，則確定所述n糖鏈不存在斷裂，并采用緩沖液清洗過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)轉(zhuǎn)速；

18、若所述平均長(zhǎng)度差值小于等于預(yù)設(shè)平均長(zhǎng)度差值，則確定所述n糖鏈存在斷裂，并減小緩沖液清洗過(guò)程的離心機(jī)轉(zhuǎn)速；

19、其中，所述平均長(zhǎng)度差值為所述平均長(zhǎng)度與所述標(biāo)準(zhǔn)平均長(zhǎng)度的差值的絕對(duì)值；所述標(biāo)準(zhǔn)平均長(zhǎng)度為數(shù)據(jù)庫(kù)中同種n糖鏈的長(zhǎng)度的平均值。

20、進(jìn)一步地，所述緩沖液清洗過(guò)程的離心機(jī)轉(zhuǎn)速的降低幅度根據(jù)所述預(yù)設(shè)平均長(zhǎng)度差值與所述平均長(zhǎng)度差值的差值確定。

21、進(jìn)一步地，對(duì)所述燕窩蛋白質(zhì)的純化結(jié)束時(shí)刻與水解酶的加入時(shí)刻的間隔時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)整，包括：

22、獲取所述n糖鏈的結(jié)構(gòu)，并與所述數(shù)據(jù)庫(kù)中燕窩糖蛋白的分子排列結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比；

23、若在所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)上存在與所述n糖鏈的結(jié)構(gòu)相同的結(jié)構(gòu)，則確定燕窩糖蛋白存在斷裂，并增加所述加入時(shí)刻的間隔時(shí)長(zhǎng)，

24、其中，所述間隔時(shí)長(zhǎng)與存在相同結(jié)構(gòu)的n糖鏈數(shù)量成正比。

25、進(jìn)一步地，確定變性液的ph值，包括：

26、獲取所述n糖鏈的長(zhǎng)度，并計(jì)算其與所述平均長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)差；

27、獲取所述水解酶的溶液的ph值；

28、計(jì)算所述標(biāo)準(zhǔn)差與所述ph值的線性擬合度；

29、將所述線性擬合度與預(yù)設(shè)第二擬合度進(jìn)行對(duì)比；

30、若所述線性擬合度大于等于預(yù)設(shè)第二擬合度，則確定所述水解酶的ph值對(duì)n糖鏈水解反應(yīng)的干擾程度不符合要求，并獲取所述水解酶的溶液的實(shí)際ph值；

31、根據(jù)所述水解酶的溶液的實(shí)際ph值，調(diào)整所述變性液的ph值，

32、其中，所述變性液的ph值的調(diào)節(jié)方向根據(jù)所述水解酶的溶液的ph值確定。

33、進(jìn)一步地，確定電泳分離過(guò)程的上樣電壓，包括：

34、若所述線性擬合度大于等于預(yù)設(shè)第一擬合度且小于所述預(yù)設(shè)第二擬合度，則初步確定燕窩糖蛋白的水解反應(yīng)程度不符合要求；

35、采集所述純化n糖鏈溶液的濃度；

36、若所述純化n糖鏈溶液的濃度大于預(yù)設(shè)濃度，則二次確定燕窩糖蛋白的水解反應(yīng)程度不符合要求，并對(duì)電泳分離過(guò)程的上樣電壓進(jìn)行增大，

37、其中，所述上樣電壓與所述純化n糖鏈溶液的濃度成正比。

38、進(jìn)一步地，所述n糖鏈的結(jié)構(gòu)信息包括n糖鏈的組成、n糖鏈的同分異構(gòu)體數(shù)量、n糖鏈分子量和n糖鏈的遷移率。

39、進(jìn)一步地，采用磁珠懸浮離心的方式對(duì)所述標(biāo)記n糖鏈溶液中的n糖鏈進(jìn)行純化以輸出純化n糖鏈溶液，包括：

40、拿出磁珠室溫平衡10min，并將磁珠懸浮液渦旋混勻；

41、加入5ul所述磁珠懸浮液到離心管后加入30ul所述標(biāo)記n糖鏈溶液；

42、加入200ul100%乙腈，混勻后放置到磁力架上，靜置1min，棄上清液；

43、加入100ul96%乙腈，混勻后放置到磁力架上，靜置1min，棄上清液，并重復(fù)此步驟三遍后晾干以得到純化n糖鏈；

44、向晾干后的所述純化n糖鏈加入50ul蒸餾水到純化n糖鏈溶液，混勻后放置到磁力架上，靜置1min，取上清液至新的離心管。

45、進(jìn)一步地，按照所述上樣電壓對(duì)所述純化n糖鏈溶液進(jìn)行電泳分離以得到電泳圖譜，包括：

46、將所述2ul純化n糖鏈溶液加入96孔反應(yīng)板中再加入8ul?hd甲酰胺混合液；

47、在糖組儀上按照調(diào)節(jié)后的所述上樣電壓進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，并獲取所述電泳圖譜，

48、其中，所述每1ul甲酰胺混合液的混合物以及混合比例為1ul的or600liz和160ul的hd甲酰胺。

49、進(jìn)一步地，所述水解酶為pngase?f酶。

50、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明所述方法通過(guò)確定n糖鏈的斷裂情況，由于在對(duì)n糖鏈的提純過(guò)程中，由于提純環(huán)境的溫度或緩沖液的ph值過(guò)高或過(guò)低，進(jìn)而導(dǎo)致n糖鏈的獲取結(jié)果不準(zhǔn)確，通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液的離心清洗的轉(zhuǎn)速以降低離心強(qiáng)度對(duì)n糖鏈的破壞；由于離心過(guò)程的高溫導(dǎo)致糖鏈發(fā)生斷裂，糖鏈發(fā)生斷裂的作用位置在n糖鏈穿過(guò)蛋白質(zhì)的部分，通過(guò)確定糖蛋白是否存在斷裂，由于糖蛋白衰弱導(dǎo)致的糖鏈易發(fā)生斷裂，導(dǎo)致糖蛋白結(jié)構(gòu)被破壞水解進(jìn)而導(dǎo)致提純出的n糖鏈中存在糖蛋白上的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致糖蛋白上n糖鏈的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性下降，通過(guò)對(duì)糖蛋白的純化完成時(shí)刻與水解酶的加入時(shí)刻的間隔時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)整，降低純化溫度對(duì)糖蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)精準(zhǔn)性的提高；由于在水解反應(yīng)過(guò)程中水解酶活性穩(wěn)定性降低，對(duì)n糖鏈的識(shí)別切割出現(xiàn)誤差，導(dǎo)致出現(xiàn)n糖鏈被切割，通過(guò)調(diào)節(jié)水解反應(yīng)中變性液的酸堿度，改善水解反應(yīng)環(huán)境，進(jìn)而減少酶活性對(duì)n糖鏈切割錯(cuò)誤的影響，實(shí)現(xiàn)了監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確性的提高和檢測(cè)效率的提高。

51、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法通過(guò)確定n糖鏈的斷裂情況，由于n糖鏈?zhǔn)芴峒儹h(huán)境影響，如提純溫度高、溶液ph值不符合要求、離心速率過(guò)大或糖蛋白衰弱導(dǎo)致n糖鏈的連接位置易斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)的結(jié)果誤差增加，通過(guò)降低易斷裂的n糖鏈的緩沖液的離心清洗的轉(zhuǎn)速，以減少離心力對(duì)n糖鏈的破壞，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過(guò)程穩(wěn)定性的提高。

52、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法通過(guò)確定糖蛋白是否存在斷裂，由于糖蛋白衰弱導(dǎo)致的糖鏈易發(fā)生斷裂導(dǎo)致糖蛋白斷裂位置產(chǎn)生新的n糖鏈，進(jìn)而降低了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過(guò)增加純化完成時(shí)刻與水解酶的加入時(shí)刻的間隔時(shí)長(zhǎng)，以及降低純化過(guò)程中的溫度，從而減少對(duì)糖蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，增加在水解前，糖蛋白的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了酶對(duì)n糖鏈的識(shí)別和切割的準(zhǔn)確性的提高。

53、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法通過(guò)確定變性液的ph值，由于高速離心過(guò)程會(huì)導(dǎo)致pbs緩沖液得溫度升高從而導(dǎo)致部分液態(tài)成分揮發(fā)，從而導(dǎo)致緩沖液得濃度變大，當(dāng)緩沖液得濃度變大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)超濾管的清洗效果下降，進(jìn)而導(dǎo)致溶解糖蛋白中可能存在雜質(zhì)，因此會(huì)導(dǎo)致水解酶切過(guò)程中的酶識(shí)別雜質(zhì)產(chǎn)生對(duì)于溶解糖蛋白的水解位置發(fā)生誤差，由于在水解反應(yīng)過(guò)程中溶液的ph值發(fā)生變化導(dǎo)致水解酶穩(wěn)定性降低和對(duì)n糖鏈的水解位置的識(shí)別能力下降，n糖鏈水解不完全或水解誤差量增加，進(jìn)而導(dǎo)致n糖鏈的純度和收率下降，并增加后續(xù)操作的難度，通過(guò)調(diào)節(jié)變性液的ph值，減小水解過(guò)程中的ph值變化對(duì)酶活性的影響，實(shí)現(xiàn)了酶活性的穩(wěn)定性的增加。

54、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法通過(guò)確定燕窩糖蛋白的水解反應(yīng)程度是否符合要求，由于水解反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)溶液的ph值發(fā)生變化導(dǎo)致水解酶活性不穩(wěn)定，n糖鏈釋放量增加，高濃度的n糖鏈會(huì)導(dǎo)致增加電泳緩沖液的粘度導(dǎo)致n糖鏈的聚集和沉淀，通過(guò)增加上樣電壓，增大電流密度使電泳速度加快進(jìn)而減少沉積現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了增加檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

55、進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法通過(guò)獲取電泳圖譜對(duì)n糖鏈進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)n糖鏈進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法高效液相、質(zhì)譜分析的局限性，通過(guò)電泳的檢測(cè)方法確定n糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)而確定已知n糖鏈的組成類型，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)效率的提高。