本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)，具體涉及一種基于雙酶級(jí)聯(lián)催化的熒光/比色雙模態(tài)檢測(cè)腸毒素b的方法。

背景技術(shù)：

1、金黃色葡萄球菌是最常見的食源性病原體之一，被認(rèn)為是世界各地食源性疾病的主要原因。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素是是誘發(fā)食物中毒的主要毒力因子，易引起人體腹痛、胃痙攣和嘔吐等癥狀。目前，已確定23種腸毒素為不同的血清學(xué)實(shí)體，其中，腸毒素b(seb)是葡萄球菌食物中毒毒性最強(qiáng)的類型之一。由于其緊密的三級(jí)結(jié)構(gòu)，腸毒素b具有較強(qiáng)的耐高溫性，在高溫蒸煮后仍保留其致病毒性。腸毒素b的致死劑量為20ng/kg，而<0.4ng/kg的劑量便會(huì)引起臨床癥狀。因此，快速靈敏地檢測(cè)食品樣品中腸毒素b對(duì)降低葡萄球菌食物中毒風(fēng)險(xiǎn)和控制食品安全具有重要意義。

2、目前，腸毒素b的檢測(cè)方法主要有色譜法、分子生物學(xué)法和免疫學(xué)方法，并且已經(jīng)開發(fā)出用于商業(yè)試劑盒的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)。這些方法對(duì)腸毒素b的檢測(cè)表現(xiàn)出良好的性能，但同時(shí)受到各自固有缺點(diǎn)的制約；如色譜過程耗時(shí)、分子生物學(xué)方法的假陰性結(jié)果、免疫學(xué)方法的高昂價(jià)格。近年來，傳感器檢測(cè)方法因其響應(yīng)快速和預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。然而，現(xiàn)有的傳感器檢測(cè)腸毒素b仍有不足：一方面是傳感器的檢測(cè)靈敏度仍有待提高；另一方面是大多數(shù)納米傳感器對(duì)腸毒素b的檢測(cè)都是單模態(tài)檢測(cè)，僅提供一種輸出信號(hào)，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性的檢測(cè)結(jié)果。因此，迫切需要建立一種靈敏、快速、高效的腸毒素b檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有方法的不足，本發(fā)明提供了一種基于雙酶級(jí)聯(lián)催化的熒光/比色雙模態(tài)檢測(cè)腸毒素b的方法；首先制備了雙模擬催化納米酶bio-nh2@mof-818，其具有良好的熒光性能，且能逐步催化底物3,5-二叔丁基鄰苯二酚和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺產(chǎn)生可見信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)食品中腸毒素b的快速檢測(cè)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下；

3、一種基于雙酶級(jí)聯(lián)催化的熒光/比色雙模態(tài)檢測(cè)腸毒素b的方法，包括如下步驟：

4、s1.雙模擬催化納米酶bio-nh2@mof-818復(fù)合納米材料的制備；

5、(1)制備bio-nh2納米材料：

6、首先，稱取五水合硝酸鉍，將其溶解在由n,n-二甲基甲酰胺、甘油和水組成的混合溶液中，超聲使其完全溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中進(jìn)行加熱反應(yīng)，反應(yīng)后冷卻至室溫，并用超純水和乙醇依次清洗，清洗后離心，收集沉淀物，真空干燥，獲得bio-cooh納米材料；

7、隨后，將bio-cooh納米材料和2-氨基對(duì)苯二甲酸超聲溶解在由n,n-二甲基甲酰胺和甲醇組成的混合溶液中；然后將溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中進(jìn)行加熱反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，收集反應(yīng)產(chǎn)物依次用n,n-二甲基甲酰胺、丙酮和乙醇進(jìn)行清洗，清洗后離心，收集沉淀物，真空干燥，得到bio-nh2納米材料；

8、(2)合成mof-818納米材料：首先，分別稱取八水合氯氧化鋯、五水合硝酸銅和4-吡唑羧酸，溶于n,n-二甲基甲酰胺中，再加入三氟乙酸，混合均勻，得到混合溶液；將混合溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中進(jìn)行加熱反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，離心，收集沉淀物，真空干燥，得到mof-818納米材料；

9、(3)采用聚乙烯吡咯烷酮輔助合成方法制備bio-nh2@mof-818復(fù)合納米材料：首先，將步驟(1)合成的bio-nh2納米材料和聚乙烯吡咯烷酮溶于n,n-二甲基甲酰胺中，攪拌均勻后進(jìn)行離心，收集沉淀物，將其復(fù)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，再加入步驟(2)制備的mof-818納米材料，攪拌均勻后再次離心，收集沉淀物，最后經(jīng)真空干燥，得到bio-nh2@mof-818復(fù)合納米材料；

10、優(yōu)選的，步驟s1的(1)中，五水合硝酸鉍、n,n-二甲基甲酰胺、甘油和水的的用量關(guān)系為0.5～10mmol：2～20ml：5～50ml：1～20ml；bio-cooh納米材料、2-氨基對(duì)苯二甲酸、n,n-二甲基甲酰胺和甲醇的用量關(guān)系為0.05～2mmol：0.025～1mmol：5～40ml：1～10ml；超聲的時(shí)間均為5～10min。

11、優(yōu)選的，步驟s1的(1)中，加熱反應(yīng)的溫度均為100～150℃，加熱時(shí)間均為12～72小時(shí)；所述離心的條件均為：轉(zhuǎn)速為5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為2～20分鐘；所述真空干燥的溫度均為30～70℃，時(shí)間均為3～48小時(shí)。

12、優(yōu)選的，步驟s1的(2)中，八水合氯氧化鋯、五水合硝酸銅、4-吡唑羧酸、三氟乙酸和n,n-二甲基甲酰胺的用量關(guān)系為0.1～1mmol：0.1～1mmol：0.2～2mmol：0.05～1ml：20ml；所述加熱反應(yīng)的溫度為80～120℃，反應(yīng)的時(shí)間為5～24小時(shí)；所述離心的轉(zhuǎn)速為5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為5～30分鐘；所述真空干燥的溫度為30～70℃，時(shí)間為4～48小時(shí)。

13、優(yōu)選的，步驟s1的(3)中，bio-nh2納米材料、聚乙烯吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、復(fù)溶所用的n,n-二甲基甲酰胺以及mof-818納米材料的用量關(guān)系為10～200mg：2～50mg：2～50ml：2～50ml：10～500mg；攪拌的溫度均為15～50℃，攪拌時(shí)間均為6～72小時(shí)；所述離心轉(zhuǎn)速均為5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間均為5～30分鐘；所述真空干燥溫度為30～70℃，干燥時(shí)間為4～48小時(shí)。

14、s2.獲取熒光信號(hào)和比色信號(hào)；

15、(1)配制腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制n個(gè)不同濃度梯度的腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為c1，c2，c3，c4，……cn-1，cn，其中n為正整數(shù)；

16、(2)獲取熒光信號(hào)：首先，將bio-nh2@mof-818復(fù)合納米材料溶于超純水中，得到bio-nh2@mof-818溶液；再將腸毒素b的適配體與bio-nh2@mof-818溶液混合，進(jìn)行第一次孵育；在第一次孵育后的溶液中加入腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行第二次孵育；隨后，在第二次的孵育溶液中依次加入3,5-二叔丁基鄰苯二酚溶液和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液，進(jìn)行第三次孵育，得到待測(cè)溶液；不同濃度腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的待測(cè)溶液依次記為d1，d2，d3，d4，……dn-1，dn；最后，將待測(cè)溶液分別測(cè)量并記錄熒光發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度，依次記為f1，f2，f3，f4，……fn-1，fn，其中n均為正整數(shù)；

17、(3)獲取比色信號(hào)：

18、每測(cè)量一個(gè)待測(cè)溶液的熒光信號(hào)后，繼續(xù)測(cè)定并記錄紫外吸收峰處的吸光度，依次記為a1，a2，a3，a4，……an-1，an，其中n為正整數(shù)；

19、優(yōu)選的，步驟s2的(1)中所述腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍為1×10-9～100ng/ml。

20、優(yōu)選的，步驟s2的(2)中，腸毒素b的適配體、bio-nh2@mof-818溶液、腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液、3,5-二叔丁基鄰苯二酚溶液和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液的用量關(guān)系為0.005～1ml：0.05～5ml：0.1～2ml：0.05～1ml：0.05～1ml，其中腸毒素b的適配體溶液濃度為1nm～10μm，bio-nh2@mof-818溶液的濃度范圍為10～1000μg/ml，3,5-二叔丁基鄰苯二酚溶液的濃度范圍為0.05～5mmol/l，3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液的濃度范圍為0.1～5mmol/l。

21、優(yōu)選的，步驟s2的(2)中，第一次孵育的時(shí)間為10～60分鐘；第二次孵育的時(shí)間為5～60分鐘；第三次孵育的時(shí)間為2～30分鐘；所述孵育溫度均為2～40℃；測(cè)量并記錄熒光發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)為300～400nm，熒光發(fā)射峰位于380～450nm。

22、優(yōu)選的，步驟s2的(3)中，紫外吸收峰處位于330～450nm。

23、s3.建立熒光/比色快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型；

24、(1)建立熒光快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型：

25、利用步驟s2的(1)中腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與步驟s2的(2)中對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度建立模型，得到腸毒素b的熒光快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型f＝f(x)，其中f為熒光強(qiáng)度，x為腸毒素b濃度；

26、(2)建立比色快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型：

27、利用步驟s2的(1)中腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與步驟s2的(3)中對(duì)應(yīng)的吸光度a1，a2，a3，a4，……an-1，an分別建立模型，得到腸毒素b的比色快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型y＝y(tǒng)(x)，其中y為吸收峰處的吸光度，x為腸毒素b的濃度。

28、s4.檢測(cè)樣品中腸毒素b的含量；

29、將待測(cè)樣品，均質(zhì)后加入提取液，混合、離心后收集上清液，再加入脂肪提取液，震蕩、離心后去除脂肪層，即為樣品待測(cè)液；

30、按照步驟s2的操作，區(qū)別是將腸毒素b標(biāo)準(zhǔn)溶液替換為樣品待測(cè)液，最后獲取樣品待測(cè)液的的熒光強(qiáng)度和吸光度，將其分別代入步驟s3中建立的熒光快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型和比色快速檢測(cè)預(yù)測(cè)模型，即可實(shí)現(xiàn)熒光法和比色法對(duì)腸毒素b的快速檢測(cè)。

31、優(yōu)選的，步驟s4中所述待測(cè)樣品、提取液與脂肪提取液的用量關(guān)系為2～100g：5～500ml：5～500ml；其中待測(cè)樣品為淀粉類、牛乳及乳制品、肉類或蛋類，提取液為pbs緩沖液，脂肪提取液為正庚烷；所述震蕩時(shí)間為2～30分鐘，離心轉(zhuǎn)速為5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為2～30分鐘。

32、本發(fā)明的有益效果：

33、(1)本發(fā)明制備的雙模擬催化納米酶具有高效的催化效率，能在短時(shí)間內(nèi)催化底物3,5-二叔丁基鄰苯二酚和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺并產(chǎn)生顯著的信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)腸毒素b的快速檢測(cè)。

34、(2)雙酶級(jí)聯(lián)催化不僅將單一底物轉(zhuǎn)化為更多的信號(hào)分子，減少中間產(chǎn)物的損耗，有效放大檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，提高檢測(cè)靈敏度；而且通過減少中間體在酶之間的擴(kuò)散，有效提高了中間體的利用率，從而進(jìn)一步提高了催化效率，提高腸毒素b檢測(cè)的靈敏度。

35、(3)本發(fā)明構(gòu)建的雙模態(tài)傳感器結(jié)合了熒光和比色兩種檢測(cè)模式，能夠利用兩個(gè)模態(tài)的輸出信號(hào)相互驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果，提高腸毒素b檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

36、(4)本發(fā)明所提出的腸毒素b雙酶級(jí)聯(lián)催化傳感檢測(cè)方法，對(duì)腸毒素b的檢測(cè)水平低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，符合日常檢測(cè)需求，并可用于多種食品農(nóng)產(chǎn)品中腸毒素b的快速檢測(cè)。