本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種瑞香狼毒總二萜的制備方法，特別是涉及一種采用萃取技術(shù)和反相ODS柱層析技術(shù)聯(lián)用提取制備瑞香狼毒中總二萜的方法。

背景技術(shù)：

瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)系瑞香科狼毒屬植物，俗名斷腸草，分布于中、俄、蒙、朝等國，在我國主要產(chǎn)自北方各省區(qū)及西南地區(qū)，生于海拔2600～4200米干燥而向陽的高山草坡、草坪或河灘臺地。其味苦辛，性平，有大毒，入肺脾肝經(jīng)，根入藥，有逐水祛痰、破積殺蟲之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明瑞香狼毒具有很好的抗腫瘤活性，最新研究還發(fā)現(xiàn)其具有抗病毒、抗菌、抗驚厥和免疫調(diào)節(jié)等作用。目前，從瑞香狼毒中分離鑒定出的化學(xué)成分主要有二萜類、倍半萜類、黃酮類、香豆素類、木脂素類等，其中，瑞香狼毒中的二萜類成分含量極低，但具有很好的藥理活性。如尼地嗎啉(gnidimacrin)對人類白血病K562，胃癌Kato-Ⅲ、MKN-28、MKN-45等細(xì)胞系均具有強烈的抑制作用，其IC₅₀值可達(dá)0.12ng/mL(Feng W,et al.CHINESE J CANCER RES,1996.17(02))；狼毒酯A～C(stelleralide A～C)顯示出潛在的抗HIV活性，其EC₉₀值低至1nM(Asada Y,et al.ORG LETT,2011.13(11))；蕘花酯J(wikstroelideJ)抑制人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的IC₅₀值為0.024μM，而機理研究進(jìn)一步證明蕘花酯J是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的良好抑制劑，它能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在G2～M期的凋亡(Liu L,et al.BIOORGAN MED CHEM,2014.22(15))。諸如此類，文獻(xiàn)中對瑞香狼毒二萜藥理作用研究的報道有很多，但鮮有對其提取制備方法的報道，這說明從事這方面的研究具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明在前期研究瑞香狼毒化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，提供了一種快速制備瑞香狼毒藥材中總二萜的新工藝。以瑞香狼毒藥材為原料，經(jīng)乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及反相ODS中壓柱層析等步驟，所得流份直接減壓濃縮至干即可獲得目標(biāo)成分含量大于90％的瑞香狼毒總二萜部位。步驟為：

(1)取瑞香狼毒藥材，粉碎，置于提取釜中，加入無水乙醇浸泡2～3小時后，在減壓下50～60℃水浴加熱前煮，冷凝回流，提取3～4次，每次2～4小時。合并提取液，負(fù)壓下干燥至無醇味，得浸膏。

(2)將上述浸膏用純水超聲分散得分散液，置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，重復(fù)3～4次。之后放去水層，合并乙酸乙酯層，在負(fù)壓下蒸干，得萃取物。

(3)將上述萃取物以甲醇-水溶液分散后，濕法上樣，過反相層析柱，依次以兩個不同濃度的甲醇-水溶液洗脫，中壓泵加壓，流量控制在100～150mL/min，收集第二個甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒總二萜。

上述步驟(1)中按液料比計提取藥材所用無水乙醇的體積為藥材質(zhì)量的8～10倍。

上述步驟(2)中分散浸膏所用純水的體積為浸膏質(zhì)量的5～7倍，萃取所用乙酸乙酯的體積為分散液體積的2～3倍。

上述步驟(3)中分散萃取物所用甲醇-水溶液的體積濃度為80～85％，其體積為萃取物質(zhì)量的1～2倍。

上述步驟(3)中反相柱層析所用填料為ODS，粒徑為40～50μm。

上述步驟(3)中兩次洗脫所用甲醇-水溶液的體積濃度依次為80～85％和95～100％，洗脫后收集第二次洗脫的甲醇-水流份。

綜上所述，本發(fā)明具有的優(yōu)點為：

(1)采用無水乙醇冷浸法與減壓回流煎煮法結(jié)合，提取充分。

(2)采用純水分散、乙酸乙酯萃取的方法除去大部分水溶性雜質(zhì)，減少了后續(xù)上柱的樣品量，同時減輕了對反相柱分離的干擾，使ODS對二萜的分離能力大大增強，更能適應(yīng)規(guī)模化提取的需要。

(3)反相層析柱首先以80％甲醇-水洗脫，除去含量較高的黃酮、香豆素等成分，之后以95％甲醇-水洗下所有二萜類成分，也避免如脂肪酸等弱極性成分的引入。

(4)提取、萃取及反相柱層析等操作均在較低溫度下進(jìn)行，有效減少了二萜類成分的分解。

(5)本發(fā)明工藝簡單，產(chǎn)品目標(biāo)成分含量高、色澤好，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實施例1所得瑞香狼毒總二萜的UPLC-MS分析色譜圖。其中(a)示瑞香狼毒總二萜的UPLC-MS總離子流色譜圖(TIC)；(b)示已報道16個二萜類化合物的提取離子流色譜圖(EIC)的疊加圖。

圖2為紫外分光光度法測定實施例1所得瑞香狼毒總二萜中二萜類成分含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，實施例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。

實施例1

取瑞香狼毒藥材1kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入8L無水乙醇浸泡2小時后，水浴50℃,在減壓下煎煮3次，冷凝回流，每次2小時。之后合并3次提取液，負(fù)壓干燥得浸膏115g。將浸膏用0.6L純水超聲分散后，在分液漏斗中，加入1.2L乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次。之后放去水層，將合并的乙酸乙酯層在負(fù)壓下蒸干，得萃取物66g。將萃取物以70mL80％甲醇-水溶液分散后，濕法上樣，過40～50μm ODS反相層析柱(柱長40cm，內(nèi)徑8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脫，中壓泵加壓，流量控制在100mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒總二萜4.4g。

采用UPLC-MS對實施例1所得瑞香狼毒總二萜進(jìn)行定性分析，采用提取離子流色譜圖(EIC)及生成分子式的方法初步鑒定出16個含量較高的文獻(xiàn)已報道二萜類化合物。由此可知，所得總二萜樣品的主要成分為二萜類化合物。具體結(jié)果如表1及附圖1；圖1為實施例1所得瑞香狼毒總二萜的UPLC-MS分析色 譜圖。其中(a)示瑞香狼毒總二萜的UPLC-MS總離子流色譜圖(TIC)；(b)示已報道16個二萜類化合物的提取離子流色譜圖(EIC)的疊加圖。(色譜條件：流動相為甲醇(B)/水(A)，0～20min，80％～100％B；20～30min，100％B。質(zhì)譜條析：采用正離子模式，毛細(xì)管溫度320℃，干燥氣流速8L/min，噴霧壓力45psig，毛細(xì)管電壓3500V，碎片電壓175V，掃描電壓65V，四級桿射頻電壓750V，質(zhì)荷比范圍100-2000，其他參數(shù)為默認(rèn)。)

表1 16種瑞香狼毒總二萜中初步鑒定的二萜類化合物

以wikstroelide M為對照品(自制)，采用紫外分光光度法測定實施例1所得瑞香狼毒總二萜中二萜類成分的含量。對照品溶液用甲醇配制，濃度范圍為1.56～25μg/mL，設(shè)定檢測波長260nm，分別測定各濃度下的吸光度，并以對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為y＝0.0401x+0.014，相關(guān)系數(shù)R²＝0.9999。取實施例1所得瑞香狼毒總二萜，用甲醇溶解，稀釋成濃度為15μg/mL的溶液，測得吸光度為0.575，計算得二萜類成分含量為93.27％。相關(guān)實驗數(shù)據(jù)見表2及附圖2。

表2 對照品wikstroelide M的濃度與吸光度

實施例2

取瑞香狼毒藥材2kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入13L無水乙醇浸泡2小時后，水浴55℃,在減壓下煎煮3次，冷凝回流，每次2小時。之后合并3次提取液，負(fù)壓干燥得浸膏227g。將浸膏用1.4L純水超聲分散后，在分液漏斗中，加入3L乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次。之后放去水層，將合并的乙酸乙酯層在負(fù)壓下蒸干，得萃取物134g。將萃取物以140mL 80％甲醇-水溶液分散后，濕法上樣，過40～50μm ODS反相層析柱(柱長40cm，內(nèi)徑8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脫，中壓泵加壓，流量控制在110mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒總二萜9.0g。

實施例3

取瑞香狼毒藥材2kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入15L無水乙醇浸泡2小時后，水浴60℃,在減壓下煎煮3次，冷凝回流，每次3小時。之后合并3次提取液，負(fù)壓干燥得浸膏231g。將浸膏用2L純水超聲分散后，在分液漏斗中，加入4L乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次。之后放去水層，將合并的乙酸乙酯層在負(fù)壓下蒸干，得萃取物145g。將萃取物以150mL 80％甲醇-水溶液分散后，濕法上樣，過40～50μm ODS反相層析柱(柱長40cm，內(nèi)徑8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脫，中壓泵加壓，流量控制在120mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒總二萜9.8g。

實施例4

取瑞香狼毒藥材5kg，粉碎成粗粉，置于提取釜中，加入50L無水乙醇浸泡2小時后，水浴60℃,在減壓下煎煮3次，冷凝回流，每次4小時。之后合并3次提取液，負(fù)壓干燥得浸膏618g。將浸膏用4L純水超聲分散后，在分液漏斗中，加入5L乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次。之后放去水層，將合并的乙酸乙酯層在負(fù)壓下蒸干，得萃取物335g。將萃取物以400mL 80％甲醇-水溶液分散后，濕法上樣，過40～50μm ODS反相層析柱(柱長40cm，內(nèi)徑8cm)，依次以80％、95％甲醇-水溶液充分洗脫，中壓泵加壓，流量控制在150mL/min，收集95％甲醇-水流份，干燥即得瑞香狼毒總二萜22.4g。