本發(fā)明屬于病原菌檢測，具體涉及一種海洋沉積物中三種病原菌的現(xiàn)場同步定量測定方法。

背景技術(shù)：

1、海洋沉積物是指在海洋環(huán)境中，由水體、氣候、地質(zhì)活動等因素作用下，沉積于海底的固體顆粒物質(zhì)。這些沉積物中含有豐富的微生物群落，包括細(xì)菌、古菌、真菌和原生生物等。其中，副溶血性弧菌(v.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(v.alginolyticus)和大腸桿菌o157(e.coli?o157)是海洋沉積物中常見的水生致病菌。

2、v.parahaemolyticus主要存在于海洋及沿海環(huán)境中，食用受其污染的海產(chǎn)品(如生蠔和生魚片)可引發(fā)食物中毒，表現(xiàn)為急性胃腸炎的癥狀，包括腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐和發(fā)熱，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致危及生命的并發(fā)癥。v.alginolyticus是一種革蘭氏陰性桿菌，主要存在于海水和海產(chǎn)品中，具有高度致病性。它可以通過食用受污染的海產(chǎn)品或通過皮膚傷口接觸海水而感染人體，引發(fā)嚴(yán)重的皮膚感染、軟組織感染和敗血癥等臨床癥狀，甚至可能導(dǎo)致休克或死亡。e.coli盡管通常與腸道相關(guān)，但也可在海洋環(huán)境中被檢測到，可能來源于污水排放、動物糞便或其他污染源，其在海洋環(huán)境中的存在對海水和海產(chǎn)品的衛(wèi)生安全具有潛在影響。

3、檢測海洋沉積物中細(xì)菌的方法，無論是基于“細(xì)胞分離-培養(yǎng)”還是“基因提取-分析”，都依賴大量的設(shè)備和專業(yè)的實驗室。最常見的平板培養(yǎng)計數(shù)法和pcr法都存在效率上的局限性——需要分離、純化細(xì)菌，然后培養(yǎng)、鑒定，或者通過復(fù)雜的核酸提取步驟得到dna，然后上機測定，耗時往往超過24h，難以在海上或野外環(huán)境中實現(xiàn)現(xiàn)場檢測目標(biāo)。而且，沉積物顆粒對細(xì)菌分離和dna提取的影響極大，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(loop-mediated?isothermal?amplification,lamp)技術(shù)較之于傳統(tǒng)的基因分析(如pcr及其衍生的各種變溫基因擴(kuò)增，以及基因測序等)技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢——不但儀器便攜、能耗低、效率高、特異性好，而且對體系中細(xì)胞碎屑、腐殖質(zhì)等生物大分子的存在具有一定的容忍度，因而為現(xiàn)場定性定量測定環(huán)境中的微生物提供了可能性。但是，目前采用lamp技術(shù)現(xiàn)場定性定量測定海洋沉積物中的病原微生物依然難以實現(xiàn)，這是因為現(xiàn)有能夠定量lamp結(jié)果的光學(xué)檢測結(jié)果往往會被來自于沉積物的顆粒物干擾，而且，常見lamp體系必需bst?dna聚合酶，該酶不但價格昂貴，而且在船上、野外實驗條件下還不穩(wěn)定，容易失活。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供現(xiàn)場同步定量測定海洋沉積物中v.parahaemolyticus、v.alginolyticus和e.coli?o157的方法，本發(fā)明方法能夠在1h內(nèi)完成海洋沉積物中v.parahaemolyticus、v.alginolyticus和e.coli?o157的同步檢測。

2、本發(fā)明方法工作原理為：在目標(biāo)站點(船上或岸邊)采用一次性管狀無菌取樣器取到1ml沉積物樣品，擠進(jìn)預(yù)裝有9ml無菌人工海水的無菌離心管，手動振蕩，然后在室溫下離心使顆粒物沉淀，以離心管中的上清液作為lamp擴(kuò)增的模板。取3μl模板加入含有特制lamp反應(yīng)體系(以聚山梨醇單油酸酯(吐溫80)代替甜菜堿和bst?dna聚合酶)的一次性檢測管中后，將檢測管放入基于電容耦合非接觸電導(dǎo)原理的便攜式電子等溫基因擴(kuò)增儀中，在58℃下進(jìn)行50min的擴(kuò)增反應(yīng)。在lamp擴(kuò)增過程中，核苷酸聚合形成雙鏈dna時，會生成焦磷酸鎂和氫離子，這些產(chǎn)物會引起反應(yīng)體系電容耦合非接觸電導(dǎo)值(c4)的變化，該變化值(δc4)被電子等溫基因擴(kuò)增儀實時記錄。通過繪制lamp反應(yīng)過程中δc4與時間t的關(guān)系曲線，建立生化過程動力學(xué)曲線(δc4-t曲線)。電子等溫基因擴(kuò)增儀自動對δc4-t曲線取一階導(dǎo)數(shù)，報告反應(yīng)速率曲線(dv/dt-t曲線)，dv/dt-t曲線的峰值tp即lamp生化反應(yīng)的最大速率時間點。tp與沉積物樣品中細(xì)菌含量的log值呈線性關(guān)系。采用線性回歸法關(guān)聯(lián)分析模板中細(xì)菌與峰值tp之間的關(guān)系函數(shù)，建立微生物標(biāo)志基因的定量分析方法以測定目標(biāo)細(xì)菌。

3、本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

4、一種海洋沉積物中三種病原菌的現(xiàn)場同步定量測定方法，所述方法為非疾病診斷和預(yù)防的目的，所述方法為：

5、步驟一、采集海洋沉積物樣品放入裝有無菌海水的離心管中，混勻、離心，取上清液作為lamp擴(kuò)增的模板；

6、步驟二、取上清液分別加入到預(yù)裝有v.parahaemolyticus、v.alginolyticus和e.coli?o157的lamp反應(yīng)體系的檢測管中并密封；加入模板后，v.parahaemolyticus檢測管中引物vp-f3和vp-b3的濃度均為0.2μmol/l，vp-fip和vp-bip的濃度均為1.6μmol/l，dntps的濃度為1.4mmol/l，mgso4的濃度為2.0mmol/l，吐溫80濃度為0.3mmol/ml；

7、v.alginolyticus檢測管中引物va-f3和va-b3的濃度均為0.2μmol/l，va-fip和va-bip的濃度均為1.6μmol/l，va-lb的濃度為0.8μmol/l，dntps的濃度為1.4mmol/l，mgso4的濃度為2.0mmol/l，吐溫80濃度為0.3mmol/ml；

8、e.coli?o157的檢測管中引物ec-f3和ec-b3的濃度均為0.2μmol/l，ec-fip和ec-bip的濃度均為1.6μmol/l，ec-lf和ec-lb的濃度為0.8μmol/l，dntps的濃度為1.4mmol/l，mgso4的濃度為2.0mmol/l，吐溫80濃度為0.3mmol/ml；

9、步驟三、檢測管置入便攜式電子等溫基因擴(kuò)增儀的檢測通道中，測定δc4-t曲線、dv/dt-t曲線和tp；儀器工作參數(shù)：溫度為58℃、激勵電壓19v、激勵頻率4mhz、δc4采集周期1s，采集時長50min；

10、步驟四、δc4-t曲線、dv/dt-t曲線和tp測定完畢后，將tp值代入工作曲線公式計算出一次性檢測管中對應(yīng)海洋沉積物樣品的v.parahaemolyticus、v.alginolyticus和e.coli?o157濃度：3種細(xì)菌的工作曲線回歸方程分別為：

11、v.parahaemolyticus：tp(s)＝-197.51logc(cfu/ml)+1857.5(r2＝0.9971)；

12、v.alginolyticus：tp(s)＝-267.05logc(cfu/ml)+2584.5(r2＝0.9706)；

13、e.coli?o157：tp(s)＝-199.11logc(cfu/ml)+1770.7(r2＝0.9998)。

14、進(jìn)一步，所述的v.parahaemolyticus引物序列分別為(5’-3’)：

15、vp-f3：gactgccattcatttgatgt(seq?id?no.1)；

16、vp-b3：actcgtatgagaacgtgac(seq?id?no.2)；

17、vp-fip：atgtaggccagggtgcggatatggcgatggtggcattg(seq?id?no.3)；

18、vp-bip：ccgctctgggtaatggtcgtttctaacgctgcgcttgctc。(seq?id?no.4)；

19、e.coli?o157引物序列分別為(5’-3’)：

20、ec-f3：ggtggaatggttgtcacga；(seq?id?no.5)；

21、ec-b3：tggacttgtacaagactgttga；(seq?id?no.6)；

22、ec-fip：aacgtcatgccaatattgcctatgtatgacaaaacactttatgaccgt；(seq?idno.7)；

23、ec-bip：ggatgacaaatatctgcgctgctattcagcaatttcacgttttcgtgatat；(seq?idno.8)；

24、ec-lf：cagctaatccttggcctttaaaatg(seq?id?no.9)；

25、ec-lb：tagcccagttagaacaagctgat(seq?id?no.10)；

26、v.alginolyticus引物序列分別為(5’-3’)：

27、va-f3：cagcacgcgtacttaccg；(seq?id?no.11)；

28、va-b3：tcagcaccgattgatgacg；(seq?id?no.12)；

29、va-fip：ttgcgcatataccagtgctgggttttcaagtgacccagtggcttac；(seq?id?no.13)；

30、va-bip：tgggcagtggaacgagcaatttttttcctcagagcaaaatcgccta；(seq?id?no.14)；

31、va-lb：aaccaaacagaccttgccga,(seq?id?no.15)。

32、進(jìn)一步，提前做好便攜式電子等溫基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增三種菌的工作曲線。

33、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對比的有益效果：

34、(1)操作簡便：沉積物樣品經(jīng)混合并離心后，所得上清液直接裝入一次性檢測管作為lamp的模板，無需進(jìn)一步純化和dna提取步驟；電子等溫基因擴(kuò)增儀全自動測定lamp反應(yīng)過程并給出tp數(shù)據(jù)，無需其它輔助操作；

35、(2)現(xiàn)場檢測：除便攜式電子等溫基因擴(kuò)增儀和便攜式離心機之外無需其它儀器裝備，也無需攜帶容易失活的生物酶，使得在岸邊和船上現(xiàn)場測定成為可能；

36、(3)高效：從采樣到得到沉積物中v.parahaemolyticus、v.alginolyticus和e.coli?o157含量的全部耗時不超過1h；

37、(4)成本低：因反應(yīng)無需bst?dna聚合酶和甜菜堿，lamp檢測的成本降低了至少50％。