專利名稱：應用近紅外光譜分析技術制備銀杏葉提取物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥提取物生產(chǎn)過程的控制，具體涉及一種應用近紅外光譜分析技術制備銀杏葉提取物的方法，屬于中藥制劑技術領域。
背景技術：
銀杏葉為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥葉，具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功能。銀杏葉中含有天然活性黃酮及苦內(nèi)酯等與人體健康有益的多種成份，具有溶解膽固醇，擴張血管的作用，對改善腦功能障礙、動脈硬化、高血壓、眩暈、耳鳴、頭痛、老年癡呆、記憶力減退等有明顯效果，對人體的腦循環(huán)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等疾病有很好療效。大量的藥理實驗結(jié)果顯示，在多種化學活性成分中，酮類和萜內(nèi)酯是銀杏葉發(fā)揮獨特藥理活性的有效成分，對如何安全、有效地從銀杏葉中提取這兩類化合物，以及如何快速、準確的測定銀杏葉或銀杏葉提取物(GBE)中的黃酮類或萜內(nèi)脂類化合物的含量成為多年來科研工作者研究的熱點。銀杏總黃酮和總內(nèi)酯的常規(guī)分析方法為高效液相色譜法(HPLC)，HPLC方法定量精確、重現(xiàn)性好，但分析耗時較長，運行和維護成本較高，需大量消耗化學試劑，難以滿足生產(chǎn)大批量分析和即時控制的需求。近紅外光譜技術是近年來快速發(fā)展的一種新型光譜分析技術，具有快速、準確、無污染及非破壞性等優(yōu)點。應用近紅外光譜技術同時測定銀杏提取液中總黃酮和總內(nèi)酯含量的方法也已有報道，但尚未有應用于銀杏提取過程的中間控制和大批量產(chǎn)品的檢測?，F(xiàn)在國內(nèi)銀杏葉提取物生產(chǎn)方法，按照藥典方法:采用一定濃度乙醇提取，濃縮，上大孔樹脂吸附分離，洗脫，收集洗脫液，干燥即得銀杏葉提取物。在銀杏葉生產(chǎn)過程中，大孔樹脂吸附分離為生產(chǎn)過程中最重要的工序，在目前的生產(chǎn)方法中通過人為判斷洗脫液的顏色深淺或通過顯色劑變色判斷收集的起點與終點，此類判斷方式，無法準確有效判斷，存在滯后性，操作不便，對人的依賴性較強，容易造成由于人的疏忽或判斷失誤，造成物料損失及成本增大。發(fā)明的內(nèi)容為了進一步穩(wěn)定與提高銀杏葉提取物生產(chǎn)過程質(zhì)量，克服生產(chǎn)過程無法在線控制其質(zhì)量缺陷，本發(fā)明通過對銀杏葉吸附解析過程主要有效成分黃酮與內(nèi)酯的現(xiàn)場連續(xù)取樣及實驗室定量檢測，建立主要成分近紅外在線模型。通過在線模型預測實際銀杏葉洗脫液的收集起點與終點，制備出符合要求的銀杏葉提取物。本發(fā)明的技術方案為:應用近紅外光譜分析技術制備銀杏葉提取物的方法依次包括以下步驟:銀杏葉粉碎、提取、濃縮、大孔樹脂柱分離純化、收集洗脫液、濃縮、干燥；(解析溶劑使用乙醇)；其特征在于，通過在對大孔樹脂分離純化過程中進行取樣時，用近紅外光譜建立模型，控制乙醇解析過程中有效成分收集的起點與終點，具體包括下述步驟:a樣品的準備
正常生產(chǎn)時，在大孔樹脂柱層析工序中采集樣品，樣品采集多個，每兩個采集時間間隔固定；b.銀杏葉黃酮含量的檢測對步驟a所采集樣品中的銀杏黃酮和內(nèi)酯一一利用HPLC法進行準確的含量測定;銀杏黃酮HPLC檢測的色譜條件:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相:甲醇:0.4% 磷酸(50:50);流速:1.0ml/min ;進樣量:10μ L ;檢測波長:360nm ；銀杏內(nèi)酯HPLC檢測的色譜條件:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相:正丙醇:四氫呋喃:水(I:15:84);流速:1.0ml/min ;進樣量:10yL ;檢測波長:360nm ；銀杏黃酮含量的變化如圖1(a)，銀杏內(nèi)酯含量變化如圖1(b)，可見在乙醇洗脫的過程中銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯均呈現(xiàn)明顯的先升高后下降的規(guī)律；c..建立模型Cl.光譜預處理由于洗脫液體系中主要部分是水和乙醇；而乙醇和水在近紅外區(qū)內(nèi)均有一定吸收；考慮到洗脫液中水和乙醇的組成比例在不斷改變，為獲得良好的光譜數(shù)據(jù)，應在穩(wěn)定的實驗條件下進行光譜掃描，掃描模式設為“Ratio mode”，因為這種方式可以有效地扣除背景變化帶來的影響；Ratio mode模式為雙光路雙檢測器的測樣方式，每次掃描樣品的光譜的同時進行光譜背景的檢測，并自動進行光譜背景剔除，因此，所采集樣品的光譜背景的針對性很強，能夠得到大量對檢測分析有利的有效信息，避免背景變化對光譜的影響；c2.獲取近紅外光譜使用近紅外光譜儀的掃描軟件對樣品進行光譜采集；操作時，將儀器的液體探頭插入燒杯中的溶液中，使液體完全覆蓋探頭的測樣口，采用透射的方式對樣品進行掃描 '為保證采集光譜的代表性，每個批次的樣品采集光譜時，在試劑瓶中3個不同位各采集I張光譜；采用透射的測樣方式，每一張光譜都是100次掃描的平均結(jié)果；波長范圍從1100nm到2300 nm，波長增量為2.0 nm ;光譜數(shù)據(jù)為比率模式下采集；c3模型的創(chuàng)建將紅外光譜采集的數(shù)據(jù)導入定量分析軟件，利用HPLC法檢測得到的含量數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)一一對應，創(chuàng)建模型；所有樣品都是在正常生產(chǎn)過程中在線取樣，銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯分別隨機挑選幾個樣品不參與建模，作為驗證集，其他的樣品建立數(shù)學模型；將經(jīng)過預處理后的光譜數(shù)據(jù)與樣品含量數(shù)據(jù)關聯(lián)，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉一驗證法(cross-validation),用The Unscrambler定量分析軟件建立模型；光譜和化學值異常值(outlier)分別采用光譜影響值Leverage和化學值誤差Residual這兩個統(tǒng)計量來檢驗剔除；經(jīng)過異常值的剔除進行逐步優(yōu)化，得到理想的校正模型；實驗證明樣品成分含量模型的線性關系非常明顯，其黃酮模型相關性為0.9888，內(nèi)酯的為0.9521 ;這充分說黃酮、內(nèi)酯具有明顯的近紅外活性，能夠產(chǎn)生明顯的近紅外吸收，所以含量和光譜圖之間呈現(xiàn)出良好的線性關系；d.模型驗證利用建立好的樣品數(shù)學模型對預測樣品進行預測驗證，算出預測偏差；實驗證明黃酮含量的絕對偏差為0.021，內(nèi)酯含量的絕對偏差為0.033 ；所以近紅外光譜儀利用光譜數(shù)據(jù)和校正模型完全能夠有效預測黃酮的含量指標；從模型的相關性以及預測偏差，充分說明了近紅外技術可以應用于銀杏葉提取物大生產(chǎn)過程中的監(jiān)控；e.結(jié)果分析從采集的樣品看在乙醇洗脫的過程中無論是銀杏黃酮還是銀杏內(nèi)酯均呈現(xiàn)含量先升高后下降的規(guī)律，而且此規(guī)律可以通過近紅外檢測到；將銀杏黃酮含量突然升高的點判定為以銀杏黃酮作為參考參數(shù)時的收集起點，下降至平穩(wěn)水平的點判定為以銀杏黃酮作為參考參數(shù)時的收集終點；將銀杏內(nèi)酯含量突然升高的點判定為以銀杏內(nèi)酯作為參考參數(shù)時的收集起點，下降至平穩(wěn)水平的點判定為以銀杏內(nèi)酯作為參考參數(shù)時的收集終點，結(jié)合兩者的變化情況判斷銀杏提取物一乙醇洗脫過程中的收集起點和終點，主要以考慮銀杏黃酮的含量變化為主；所以利用近紅外光譜分析技術完全可以實現(xiàn)對銀杏提取物大生產(chǎn)過程時柱層析工序中乙醇解析的起點和終點判斷。本發(fā)明的一種利用近紅外光譜判斷大孔樹脂分離純化銀杏提取物時，收集有效成分的起點與終點，并制備出符合標準的銀杏葉提取物的方法。本發(fā)明應用近紅外光譜技術，測定銀杏葉提取物生產(chǎn)過程中有效成分含量的含量，不僅大大提高了分析效率，節(jié)約了分析成本，還可以有效地對中間環(huán)節(jié)進行監(jiān)控，保證生產(chǎn)過程安全、有序、可靠的進行。本發(fā)明的優(yōu)點:近紅外光譜技術是近年來快速發(fā)展的一種新型光譜分析技術，快速、準確、無污染及非破壞性。應用近紅外光譜分析技術對銀杏葉中黃酮含量進行測定方法簡單，速度快，樣品無需處理，只需掃描出圖譜，然后調(diào)用樣品模型對待測成分含量進行預測即可。只要樣品化學測定方法的精度高，那么該方法的預測值精度就高，逼近真值。最關鍵的是近紅外在大生產(chǎn)過程中可以直接測得銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的含量，可以實現(xiàn)銀杏提取過程即時分析和在線控制。


圖1 (a).黃酮含量(mg/ml)的曲線圖；圖1(b).內(nèi)酯含量(mg/ml)的曲線圖；圖2.樣品原始光譜圖；圖3.黃酮含量的PLSI模型；圖4.內(nèi)酯含量的PLSI模型。具體實施方法實例I1.樣品準備:正常生產(chǎn)時，在大孔樹脂柱層析工序中采集樣品，樣品采集多個，每兩個采集時間間隔固定。共采集65個樣品。2.銀杏葉黃酮含量的檢測對步驟I所采集樣品中的銀杏黃酮和內(nèi)酯一一利用HPLC法進行準確的含量測定。銀杏黃酮HPLC檢測的色譜條件:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相:甲醇:0.4% 磷酸(50:50);流速:1.0ml/min ;進樣量=IOyL ;檢測波長:360nm。銀杏內(nèi)酯HPLC檢測的色譜條件:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相:正丙醇:四氫呋喃:水(I:15:84);流速:1.0ml/min ;進樣量:10yL ;檢測波長:360nm。HPLC檢測結(jié)果見表1.
表1.樣品數(shù)據(jù)表
權利要求
1.一種應用近紅外光譜分析技術制備銀杏葉提取物的方法依次包括以下步驟:銀杏葉粉碎、提取、濃縮、大孔樹脂柱分離純化、收集洗脫液、濃縮、干燥；(解析溶劑使用乙醇)；其特征在于，通過在對大孔樹脂分離純化過程中進行取樣時，用近紅外光譜建立模型，控制乙醇解析過程中有效成分收集的起點與終點，具體包括下述步驟: a.樣品的準備 正常生產(chǎn)時，在大孔樹脂柱層析工序中采集樣品，樣品采集多個，每兩個采集時間間隔固定； b.銀杏葉黃酮含量的檢測 對步驟a所采集樣品中的銀杏黃酮和內(nèi)酯一一利用HPLC法進行準確的含量測定； 銀杏黃酮HPLC檢測的色譜條件:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相:甲醇:.0.4% 磷酸(50:50);流速:1.0ml/min ;進樣量:10μ L ;檢測波長:360nm ； 銀杏內(nèi)酯HPLC檢測的色譜條件:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相:正丙醇:四氫呋喃:水(I:15:84);流速:1.0ml/min ;進樣量:10 μ L ;檢測波長:360nm ； c..建立模型 Cl.光譜預處理 在穩(wěn)定的實驗條件下進行光譜掃描，掃描模式設為“Ratio mode”，每次掃描樣品的光譜的同時進行光譜背景的檢測，并自動進行光譜背景剔除；c2.獲取近紅外光譜使用近紅外光譜儀的掃描軟件對樣品進行光譜采集；操作時，將儀器的液體探頭插入燒杯中的溶液中，使液體完全覆蓋探頭的測樣口，采用透射的方式對樣品進行掃描；為保證采集光譜的代表性，每個批次的樣品采集光譜時，在試劑瓶中3個不同位各采集I張光譜；采用透射的測樣方式，每一張光譜都是100次掃描的平均結(jié)果；波長范圍從1100 nm到.2300 nm，波長增量為2.0 nm ;光譜數(shù)據(jù)為比率模式下采集；c3模型的創(chuàng)建 將紅外光譜采集的數(shù)據(jù)導入定量分析軟件，利用HPLC法檢測得到的含量數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)一一對應，創(chuàng)建模型；所有樣品都是在正常生產(chǎn)過程中在線取樣，銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯分別隨機挑選幾個樣品不參與建模，作為驗證集，其他的樣品建立數(shù)學模型； 將經(jīng)過預處理后的光譜數(shù)據(jù)與樣品含量數(shù)據(jù)關聯(lián)，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉一驗證法(cross-validation),用The Unscrambler定量分析軟件建立模型；光譜和化學值異常值(outlier)分別采用光譜影響值Leverage和化學值誤差Residual這兩個統(tǒng)計量來檢驗剔除；經(jīng)過異常值的剔除進行逐步優(yōu)化，得到理想的校正模型； d.模型驗證 利用建立好的樣品數(shù)學模型對預測樣品進行預測驗證，算出預測偏差； e.結(jié)果分析 將銀杏黃酮含量突然升高的點判定為以銀杏黃酮作為參考參數(shù)時的收集起點，下降至平穩(wěn)水平的點判定為以銀杏黃酮作為參考參數(shù)時的收集終點；將銀杏內(nèi)酯含量突然升高的點判定為以銀杏內(nèi)酯作為參考參數(shù)時的收集起點，下降至平穩(wěn)水平的點判定為以銀杏內(nèi)酯作為參考參數(shù)時的收集終點，結(jié)合兩者的變化情況判斷銀杏提取物一乙醇洗脫過程中的收集起點和終點，主要以考慮銀杏黃酮的含量變化為主。
全文摘要
應用近紅外光譜分析技術制備銀杏葉提取物的方法，通過在對大孔樹脂分離純化過程中進行取樣時，用近紅外光譜建立模型，控制乙醇解析過程中有效成分收集的起點與終點,具體包括下述步驟a樣品的準備、b.銀杏葉黃酮含量的檢測、c.建立模型光譜預處理、獲取近紅外光譜、模型的創(chuàng)建d.模型驗證,e.結(jié)果分析，主要以考慮銀杏黃酮的含量變化為主；本發(fā)明測定方法簡單，速度快，樣品無需處理，只需掃描出圖譜，然后調(diào)用樣品模型對待測成分含量進行預測即可，可以實現(xiàn)銀杏提取過程即時分析和在線控制。
文檔編號G01N21/35GK103115892SQ20131002533
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權日2013年1月23日
發(fā)明者王如偉, 葉劍鋒, 姚德中, 姚建標, 蘇一多, 錢笑芳 申請人:浙江康恩貝制藥股份有限公司