本發(fā)明屬于生物分析與色譜-質(zhì)譜檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于干血點(diǎn)或干血吸頭采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法。

背景技術(shù)：

1、血液是人體代謝活動(dòng)的重要載體，其中的代謝物能夠反映生理狀態(tài)和疾病發(fā)展過程，因此血液代謝物的分析在臨床診斷、代謝組學(xué)研究、疾病篩查及個(gè)性化醫(yī)療等領(lǐng)域具有重要意義。揮發(fā)性脂肪酸和脂肪醛是血液中關(guān)鍵的內(nèi)源性代謝物，在炎癥反應(yīng)、能量代謝、腸道菌群平衡及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等生理病理過程中發(fā)揮重要作用。例如，揮發(fā)性脂肪酸參與短鏈脂肪酸代謝，與糖尿病、心血管疾病及腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，而揮發(fā)性脂肪醛則可作為脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。

2、血液采集是進(jìn)行血液中揮發(fā)性脂肪酸和脂肪醛代謝物分析的重要。在血液采集方式方面，分為靜脈采樣和末梢血采樣兩種方式。常規(guī)檢測通常依賴靜脈血采樣，但該方法需要專業(yè)醫(yī)護(hù)人員操作，采血量較大，且對儲存和運(yùn)輸條件要求較高，不適用于大規(guī)模篩查、兒童及老年患者或資源受限地區(qū)。相比之下，末梢血采樣(如指尖血、足跟血)是一種更為便捷、微量、可自主操作的方式，僅需微升級血樣即可完成檢測，因此在新生兒疾病篩查、慢病監(jiān)測及個(gè)性化健康管理等應(yīng)用中備受關(guān)注。

3、干血點(diǎn)(dbs)技術(shù)和干血吸頭技術(shù)(統(tǒng)稱為干血采樣技術(shù)或者干血技術(shù))是一種基于末梢血的微量采血技術(shù)，其核心優(yōu)勢在于：(1)所需血樣量極少(μl級)，適用于低樣本量分析；(2)無需冷鏈存儲，樣品穩(wěn)定性較高，便于長期保存；(3)操作簡便，易于遠(yuǎn)程采樣和郵寄；(4)降低交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，適用于大規(guī)模流行病學(xué)研究。由于這些優(yōu)勢，干血采樣技術(shù)已廣泛應(yīng)用于新生兒篩查、藥物監(jiān)測、環(huán)境暴露評估及代謝組學(xué)分析。

4、盡管干血采樣技術(shù)在血液代謝物分析方面具有諸多優(yōu)勢，但在揮發(fā)性脂肪酸和脂肪醛的檢測中仍存在明顯不足。首先，由于揮發(fā)性脂肪酸和脂肪醛的高揮發(fā)性，在干血采樣采樣及干燥過程中易發(fā)生氣相損失，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。其次，這些化合物的化學(xué)穩(wěn)定性較差，容易受環(huán)境因素(如溫度、濕度)影響，存儲過程中可能發(fā)生氧化、降解或轉(zhuǎn)化。此外，揮發(fā)性脂肪酸和脂肪醛分子結(jié)構(gòu)中缺乏生色團(tuán)和易電離基團(tuán)，導(dǎo)致其在高效液相色譜(hplc)或氣相色譜(gc)分析時(shí)色譜響應(yīng)較弱，在質(zhì)譜檢測中電離效率較低，直接檢測的靈敏度和選擇性受限，難以準(zhǔn)確測定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對目前基于干血采樣技術(shù)在揮發(fā)性脂肪酸和脂肪醛檢測中存在的缺陷和問題，本發(fā)明提供一種基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法。

2、本發(fā)明提供一種基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，包括以下步驟：s1、采用干血點(diǎn)或者干血吸頭采集微量末梢血，同步添加衍生化試劑進(jìn)行原位標(biāo)記，然后進(jìn)行干燥得到干燥后的樣本；

3、s2、將干燥后的樣本加入解吸溶劑進(jìn)行解吸得到解吸液；

4、s3、將解吸液進(jìn)行儀器分析，實(shí)現(xiàn)揮發(fā)性脂肪酸或揮發(fā)性脂肪醛的定量檢測。

5、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，步驟s1中針對揮發(fā)性脂肪酸的檢測，選擇cholamine、酰氯、酯化試劑、胺類、羥胺類的任一種作為衍生化試劑；針對揮發(fā)性脂肪醛的檢測，選擇girard’s?p、羥胺、肼類、芳香胺、苯腙類、丹磺酰氯的任一種作為衍生化試劑。

6、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，采用干血點(diǎn)技術(shù)采集微量末梢血時(shí)，使用采血針刺破末梢部位，滴取20-30μl血液至干血點(diǎn)卡或?yàn)V紙上并使血液均勻擴(kuò)散在采血區(qū)域，在血樣樣本未完全干燥時(shí)添加衍生化試劑溶液，隨后進(jìn)行干燥得到干燥后的衍生化血點(diǎn)樣本。

7、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，步驟s2中取干燥后的衍生化血點(diǎn)樣本加入解吸溶劑并震蕩或超聲處理使目標(biāo)分析物釋放得到解吸液，將解吸液離心后取上清液，將上清液進(jìn)行揮發(fā)性脂肪酸或揮發(fā)性脂肪醛的定量檢測。

8、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，采用干血吸頭采集微量末梢血時(shí)，在移液吸頭內(nèi)裝載親水纖維材料，使用微量移液定量吸取20-30μl末梢血，并通過負(fù)壓作用使血液上移吸附至纖維材料；將移液吸頭置于干燥裝置中，利用逆向排液技術(shù)使血樣均勻附著并在恒溫條件下干燥固定。

9、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，步驟s2中，將干燥后的干血吸頭添加解吸溶劑并反復(fù)吹打或輕微渦旋使目標(biāo)代謝物從纖維基質(zhì)中釋放得到萃取液，將萃取液進(jìn)行揮發(fā)性脂肪酸或揮發(fā)性脂肪醛的定量檢測。

10、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，所述解吸溶劑選自以下任一種：(a)甲醇、乙腈或丙酮中的單一溶劑；(b)甲醇、乙腈、丙酮中至少一種溶劑與水的混合溶液；(c)甲醇、乙腈、丙酮中兩種或多種溶劑的混合溶液。

11、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，采用高效液相色譜-熒光檢測、高效液相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)分析目標(biāo)衍生化產(chǎn)物，進(jìn)行揮發(fā)性脂肪酸或揮發(fā)性脂肪醛的定量檢測。

12、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，步驟s1中在進(jìn)行原位標(biāo)記時(shí)，針對揮發(fā)性脂肪酸還可以通過加入緩沖體系或催化劑促進(jìn)原位標(biāo)記反應(yīng)；針對揮發(fā)性脂肪醛還可以通過加入緩沖體系或催化劑或反應(yīng)介質(zhì)促進(jìn)原位標(biāo)記反應(yīng)。

13、上述的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，所述緩沖體系依據(jù)檢測目標(biāo)物的性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，其中：揮發(fā)性脂肪酸的衍生化反應(yīng)采用ph6.0-8.5磷酸鹽緩沖液；揮發(fā)性脂肪醛的衍生化反應(yīng)選用弱酸性緩沖液，如醋酸銨緩沖液或磷酸緩沖液；所述催化劑的選擇原則是：揮發(fā)性脂肪酸的標(biāo)記采用edc/hobt縮合劑；揮發(fā)性脂肪醛的標(biāo)記體系中加入0.05％?edta；所述反應(yīng)介質(zhì)為甲醇、乙腈或其與水的混合溶劑。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

15、1、本發(fā)明提出的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，在采樣過程中完成原位衍生化，將易揮發(fā)的脂肪酸及脂肪醛轉(zhuǎn)化為非揮發(fā)性、穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物，能夠有效避免分析物損失，避免因揮發(fā)損失導(dǎo)致的檢測偏差。

16、2、本發(fā)明的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法，所選衍生化試劑可引入生色團(tuán)或易電離基團(tuán)，提高反應(yīng)活性和轉(zhuǎn)化率，顯著提高目標(biāo)分析物的色譜分離能力和質(zhì)譜檢測信號，從而提高分析靈敏度和定量精度。3、本發(fā)明的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法能夠簡化前處理流程，在采樣時(shí)同步完成衍生化，省去了額外的衍生化步驟，簡化實(shí)驗(yàn)操作，提高檢測效率。

17、4、本發(fā)明的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法適用于多種分析平臺，所得衍生化產(chǎn)物可直接應(yīng)用于hplc-ms或gc-ms檢測，無需額外的衍生化步驟，提高實(shí)驗(yàn)的可操作性和適用性。

18、5、本發(fā)明的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法將干血點(diǎn)采樣與原位標(biāo)記結(jié)合，使樣品能夠在室溫下長期存儲，減少了對冷鏈運(yùn)輸?shù)男枨?，便于遠(yuǎn)程樣本采集和集中檢測。

19、6、本發(fā)明的基于干血采樣和原位標(biāo)記的微量末梢血揮發(fā)性脂肪酸及脂肪醛檢測方法適用于臨床疾病篩查、代謝組學(xué)研究、藥物代謝分析及生物醫(yī)學(xué)監(jiān)測，可廣泛應(yīng)用于疾病早期診斷、營養(yǎng)代謝研究及個(gè)性化醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

20、7、本發(fā)明通過優(yōu)化衍生化反應(yīng)體系，采用以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)高效標(biāo)記反應(yīng)：(1)緩沖體系：揮發(fā)性脂肪酸的衍生化反應(yīng)采用ph?6.0-8.5磷酸鹽緩沖液，用于穩(wěn)定羧酸縮合反應(yīng)；揮發(fā)性脂肪酸的衍生化反應(yīng)選用弱酸性緩沖液，包括醋酸銨緩沖液或磷酸緩沖液(ph<7)；(2)催化劑：揮發(fā)性脂肪酸標(biāo)記采用edc/hobt縮合劑進(jìn)行羧酸活化；揮發(fā)性脂肪醛標(biāo)記加入0.05％edta，抑制金屬離子催化副反應(yīng)；(3)反應(yīng)介質(zhì)：選擇甲醇、乙腈或其與水的混合溶劑，平衡試劑溶解性、反應(yīng)環(huán)境與代謝物穩(wěn)定性。