本發(fā)明涉及分析檢測，具體的，涉及一種同時測定食品中β-羥基β-甲基丁酸鹽和氨基酸的方法。

背景技術(shù)：

1、目前運動營養(yǎng)食品領(lǐng)域，對β-羥基-β-甲基丁酸鹽(hmb)與氨基酸類成分的同步檢測已經(jīng)成為一項日益緊迫的需求。hmb作為一種關(guān)鍵的肌肉生長促進(jìn)劑和抗分解劑，對于運動員和健身愛好者的健康表現(xiàn)起著不可忽視的作用。hmb的發(fā)現(xiàn)為人體提供了一種新的途徑來增強(qiáng)肌肉質(zhì)量和耐力，它能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并減少肌肉分解，從而在提升運動表現(xiàn)方面發(fā)揮重要作用。然而，hmb在食品基質(zhì)中的分離挑戰(zhàn)是一個不容忽視的問題。由于hmb與亮氨酸在結(jié)構(gòu)上存在高度的相似性，當(dāng)hmb與其他氨基酸在食品中共存時，其分離度往往較低。這一特性限制hmb在運動營養(yǎng)產(chǎn)品配方設(shè)計中的廣泛應(yīng)用，因為較低的分離度可能導(dǎo)致最終產(chǎn)品中hmb成分的濃度偏低，影響其應(yīng)有的運動營養(yǎng)效果。因此，解決hmb在食品基質(zhì)中的分離問題，不僅有助于提高其作為運動營養(yǎng)食品添加劑的價值，也將進(jìn)一步推動其在該領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展。

2、中國發(fā)明專利申請cn113804806a公開了一種燕窩中氨基酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。通過利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)，建立了燕窩中氨基酸的定量檢測方法，在12min內(nèi)即可完成燕窩中多種氨基酸成分含量的分析。該發(fā)明公開的測定方法操作簡單快速、準(zhǔn)確性高、靈敏且重現(xiàn)性好，適用于燕窩及其他富含蛋白質(zhì)食品中氨基酸含量的快速檢測。但該發(fā)明并不適用于其他物質(zhì)如β-羥基β-甲基丁酸鹽同時測定的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種同時測定食品中β-羥基β-甲基丁酸鹽和氨基酸的方法，包括以下步驟：

2、s1，取氨基酸類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和β-羥基-β-甲基丁酸鈣配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)配制內(nèi)標(biāo)溶液；

3、s2，將待測物與內(nèi)標(biāo)溶液混合，進(jìn)行超聲、離心處理，得到待測樣品；

4、s3，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以及待測樣品分別注入二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(2d-lc-ms)系統(tǒng)進(jìn)行分析。

5、所述氨基酸類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為：l-丙氨酸(l-alanine)、l-精氨酸(l-arginine)、l-天冬酰胺(l-asparagine)、l-天門冬氨酸(l-aspartic?acid)、l-胱氨酸(l-cystine)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutanoic?acid)、l-谷氨酰胺(l-glutamine)、l-谷氨酸(l-glutamicacid)、甘氨酸(glycine)、l-組氨酸(l-histidine)、l-異亮氨酸(l-isoleucine)、l-亮氨酸(l-leucine)、l-賴氨酸(l-lysine)、l-蛋氨酸(l-methionine)、l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)、l-脯氨酸(l-proline)、l-絲氨酸(l-serine)、茶氨酸(theanine)、l-蘇氨酸(l-threonine)、l-絡(luò)氨酸(l-tyrosine)、l-纈氨酸(l-valine)、n-乙酰神經(jīng)氨酸(n-acetylneuraminic?acid)。

6、所述內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為：l-苯丙氨酸-d8(l-phenylalanine-d8)、l-丙氨酸-d4(l-alanine-d4)、l-蛋氨酸-13c5,15n(l-methionine-13c5,15n)、甘氨酸-d5(glycine-d5)、l-谷氨酸-d5(l-glutamic?acid-d5)、[13c6,15n4]-l-精氨酸鹽(l-argininehydrochloride-13c6,15n4)、l-賴氨酸-d4(鹽酸鹽)(l-lysine-d4monohydrochloride)、l-酪氨酸-d4(l-tyrosine-d4)、l-亮氨酸-13c6(l-leucine-13c6)、l-脯氨酸-d3(l-proline-d3)、l-絲氨酸-13c3,15n(l-serine-13c3,15n)、l-天門冬氨酸-d3(l-aspartic?acid-d3)、l-無水天冬酰胺酸-d3(水合物)(l-asparagine-d3?hydrate)、l-纈氨酸-13c3,15n(l-valine-13c5,15n)、l-異亮氨酸-d10(l-isoleucine-d10)、l-組氨酸鹽水合物-[13c6](l-histidine-13c6,15n3?hydrochloride?monohydrate)、l-茶氨酸-d5(l-threonine-d5)、β-羥基-β-甲基丁酸鈣-d6(hmb-d6)。

7、所述二維液相色譜包括第一維液相色譜和第二維液相色譜；所述第一維液相色譜和第二維液相色譜的流動相均包括流動相a和流動相b，所述流動相a包括乙酸銨水溶液和甲酸。

8、所述流動相b包括乙酸銨水溶液、乙腈和甲酸。

9、所述乙酸銨水溶液中乙酸銨的濃度為5-20mmol/l。

10、可選的，所述乙酸銨水溶液中乙酸銨的濃度為8-15mmol/l。

11、所述流動相a中甲酸的體積占比為0.01-0.5％。

12、可選的，所述流動相a中甲酸的體積占比為0.05-0.15％。

13、所述流動相b中乙腈的體積占比為80-95％。

14、可選的，所述流動相b中乙腈的體積占比為85-95％。

15、所述第一維液相色譜的色譜柱顆粒類型為hss(高強(qiáng)度硅膠顆粒)，色譜柱的鍵合相為t3(三鍵合c18，端基封尾)。

16、所述第二維液相色譜的色譜柱顆粒類型為beh(亞乙基橋雜化顆粒)，色譜柱的鍵合相為酰胺基團(tuán)。

17、所述第一維液相色譜梯度洗脫程序包括：0-15min，流動相b的體積比例為0.5-3％；15-20min，流動相b的體積比例為90-98％。

18、所述第一維液相色譜梯度洗脫的流速為：0.2-0.5ml/min。

19、所述第二維液相色譜梯度洗脫程序包括：0-0.6min，流動相b的體積比例為85-95％；0.6-0.7min(不包括端點數(shù)值)，流動相b的體積比例為5-15％；0.7-9.1min，流動相b的體積比例為95-100％；9.1-12min(不包括端點數(shù)值)，流動相b的體積比例為75-85％；12-16min，流動相b的體積比例為3-7％；

20、所述第二維液相色譜梯度洗脫的流速為：0-0.6min，流速為0.2-0.5ml/min；0.7-1.6min(不包括端點數(shù)值)，流速為1.5-2.5ml/min；1.6-9.1min，停流；9.1-16min(不包括端點數(shù)值9.1)，流速為0.2-0.5ml/min。

21、所述第二維液相色譜的捕捉柱固定相位c8(辛基)反相固定相。

22、所述質(zhì)譜條件為：采集模式為mse，電噴霧離子源(esi)，監(jiān)測模式為動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dmrm)；毛細(xì)管電壓為3500-4500v，駐留時間為30-50；碰撞氣為高純n2，壓力0.1-0.2mpa；霧化氣和干燥氣均為n2，霧化氣壓力為35-55psi，干燥氣溫度為280-300℃，干燥氣流速為8-12l/min；鞘氣溫度為290-310℃，鞘氣流速為12-16l/min。

23、本發(fā)明針對運動營養(yǎng)食品中β-羥基-β-甲基丁酸鹽(hmb)與氨基酸類成分同步檢測的行業(yè)空白，通過構(gòu)建雙色譜柱正交分離體系，突破單一色譜極性適配局限，有效解決hmb與氨基酸在復(fù)雜食品基質(zhì)中共存時分離度不足的難題；結(jié)合在線富集與梯度洗脫技術(shù)，實現(xiàn)運動補(bǔ)劑中高濃度輔料(如乳清蛋白、糖類)干擾物的自動凈化，避免傳統(tǒng)方法多次離心、萃取等繁瑣前處理。

24、所述s3檢測方法：將測試樣品注入2d-lc-ms系統(tǒng)進(jìn)行分析，該系統(tǒng)包含自動進(jìn)樣器、液相色譜柱1(第一維液相色譜的色譜柱)、液相色譜柱2(第二維液相色譜的色譜柱)、液相色譜泵1、液相色譜泵2、捕集柱、六通閥1、六通閥2和檢測器。主要包括hmb轉(zhuǎn)移、氨基酸組分分離、hmb分離三個過程；如圖1(a)所示，0～0.6min，六通閥1的3號位連接第一維親水作用液相色譜柱，2號位與六通閥2的1號位相連，六通閥2的1號位與3號位相連，3號位通向廢液，液相色譜泵1的輸出端經(jīng)過色譜柱1流入廢液；如圖1(b)所示，0.6～1.6min，控制六通閥切換，使六通閥1的5號位和4號位連接捕集柱，六通閥2的7號位連接檢測器，六通閥2的6號位連接液相色譜泵2的輸出端，8號位連接3通，用于補(bǔ)水，樣品中的hmb經(jīng)過色譜柱1流入捕集柱；如圖1(c)所示，1.6～9.0min，控制六通閥切換，使六通閥1的1號位和8號位連接，樣品中的氨基酸組分經(jīng)過色譜柱1流入檢測器；如圖1(d)所示，9.0～18.0min，控制六通閥切換，使六通閥1的7及六通閥2的5號位與色譜柱2相連，六通閥1的6號位和六通閥2的4號位相連，捕集柱中的hmb經(jīng)過色譜柱2流入檢測器。

25、有益效果

26、1.本技術(shù)可同時檢測精確檢測β-羥基β-甲基丁酸鹽和氨基酸，滿足運動營養(yǎng)食品中物質(zhì)的檢測需求。

27、2.解決了傳統(tǒng)方法分步檢測效率低、前處理繁瑣及抗干擾能力不足的難題，為運動營養(yǎng)品配方優(yōu)化提供了解決方案。

28、3.通過選擇特定的雙色譜柱正交分離體系，突破單一色譜極性適配局限，有效解決hmb與氨基酸在復(fù)雜食品基質(zhì)中共存時分離度不足的難題。

29、4.本發(fā)明質(zhì)譜采集模式為mse，電噴霧離子源(esi)，監(jiān)測模式為動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dmrm)，可提高檢測的靈敏度和特異性。

30、5.本發(fā)明通過特定的洗脫程序，可提高檢測準(zhǔn)確度以及精密度。